鐵皮石斛提取物促進肌肉損傷修復作用的機理研究＊

田林娜，李亦凡，林丹丹，范昌健，吳 鵬，盧 娟，陳際名，馬 嘯,

（1.云南農業大學體育學院 昆明 650201；2.云南農業大學龍潤普洱茶學院普洱茶學教育部重點實驗室昆明 650201；3.云南省高原特色農業產業研究院 昆明 650201）

鐵皮石斛是多年生蘭科草本植物，是一種較為常見的中草藥，近年來受到諸多媒體的關注后，具有較高的認知度和知名度。鐵皮石斛的入藥部位多為莖部，高度大約在15-30 cm之間，直徑3-7 mm，比較常見的形態為干燥后經加工成為團狀，俗稱“鐵皮楓斗”[1,2]。鐵皮石斛中的多糖類組分、石斛堿、芪類及其衍生物、生物堿、氨基酸、微量元素及揮發性成分（烴類、醛類、酮類、烯烴類、醇類、酯類等）等有較強的天然活性，具有增強免疫力、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等功效，近年來關于鐵皮石斛的新功效開發工作也在蓬勃開展。

近年來，隨著我國大眾體育與全民健身浪潮的興起、社會體育的推廣力度和收接受程度日益加深，人民群眾參與社會體育活動的熱情高漲，豐富的體育項目與運動方式為其提供多種選擇。然而，不同類型的體育項目，其運動強度的不同，勢必會對運動者機體帶來不可避免的疲勞和損傷現象。EGFR（epidermal growth factor receptor）是一種糖蛋白，是表皮生長因子受體（HER）的一種，上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導的酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR作為細胞生長因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發揮了重要的再生修復作用。根據2010年版《中華人民共和國藥典》記載，鐵皮石斛主治筋骨痿軟，骨骼肌是重要的運動器官，隨著近年來大眾運動健身習慣的養成，肌肉損傷預防和損傷恢復成了非常受關注的領域[3-5]。EGFR作為細胞生長因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發揮再生修復的作用[3-5]。因此，本研究將明確鐵皮石斛水提物對C2C12細胞和骨骼肌組織中EGFR的調控作用為目標，探明其對肌肉損傷修復作用的機理具有較強的科學價值和現實意義。。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

C2C12小鼠成肌細胞來源于美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)，細胞形態貼壁，保管條件為90%FBS(胎牛血清，fetal bovine serum)+10%DMSO（二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide）中液氮凍存，在37℃，5%CO2恒溫恒濕培養箱中無菌恒溫培養。

實驗動物選擇采用雄性SD大鼠，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，周齡為8-10周，體質量150±10 g。飼育條件：動物房溫度24℃，相對濕度50-60%，外周做隔音處理，正常環境噪音小于80分貝，24小時循環通風換氣，光周期的控制為12小時(明)/12小時(暗)，解剖實驗操作前禁食12小時,自由飲水。

選用的鐵皮石斛原料購于北京云中子商貿有限公司，原產于云南省普洱市。石斛水提取物提取工藝為，首先使用粉碎機將鐵皮石斛進行粉碎處理，按照料液比1∶30,80±10℃熱水浸出1小時后，使用雙層醫用紗布進行過濾處理，濾渣保留，按照1∶30、1∶20、1∶10的料液比反復熱水浸出3次，之后將全部濾液合并后做離心處理，取上清液；減壓濃縮至原液體積的1/6-1/8后，放入冰箱-20℃冷凍處理；使用真空冷凍干燥機對冷凍后的濃縮液進行冷凍干燥，得到干燥鐵皮石斛提取物，含水率低于2.5%，產率為15-20%。實驗用主要藥品和試劑：EGFR抗體（CellSignalingTechnology）、抗壞血酸（維生素C）[6]（阿拉丁）、乙腈（美國TEDIA）、三氟乙酸（德國MERCK）、鹽酸（阿拉丁）、氫氧化鈉（阿拉丁）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及劃痕實驗

在細胞培養板中將C2C12細胞接種,先使用含10%牛血清的DMEM培養液進行培養，至60-70%細胞出現匯合后,倒掉培養液,使用PBS進行2次清洗，然后加入含2%馬血清的DMEM分化培養液進行分化,體外分化培養C2C12細胞5天后，進行饑餓后加鐵皮石斛提取物處理，實驗分為空白對照組和不同濃度鐵皮石斛提取物組，濃度分別為20、40、80、160 ug?mL-1。處理后提取細胞蛋白，用于Western blot分析。

劃痕實驗前，確認每板細胞計數為2.5×107個。在培養皿中用無菌槍頭在每板內沿圓心畫一條“一”字，將其分為均勻的兩個部分，劃線筆直無傾斜。并在培養皿底部作上分區標記，以便拍照觀察。使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗一遍培養皿內細胞，去除劃痕劃下的細胞。此時記為0 h，在顯微鏡下觀察細胞情況并拍照，拍照完成后，進行加藥處理，并將培養皿放入37℃、5%CO2的培養箱內培養，培養2 h后于顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照[7-9]。

1.2.2 骨骼肌孵育及處理

對大鼠進行頸椎脫位處理后，將其肌肉迅速平緩地從體內取出。肌肉的兩端用縫合線捆綁，固定在孵育裝置上，靜息張力設定為0.5 g，肌肉在7 mL Krebs Ringer碳酸氫鹽緩沖液（KRB）中預孵育30分鐘，向緩沖液持續通入95%O2-5%CO2的混合氣體，并保持溫度在37℃。首先進行30分鐘預孵育，目的是消除手術過程中對肌肉組織本身直接進行物理接觸刺激帶來的應激性變化，使肌肉組織內各生理水平盡量恢復到接近于在體內的正常狀態。預孵育結束后，之后將肌肉在含有指定濃度鐵皮石斛提取物的7 mL新鮮緩沖液中孵育30分鐘，以檢測目標試劑對大鼠離體肌肉的刺激效果。然后，刺激后肌肉組織立即凍結保存，用于Western blot分析[10]。

1.2.3 Western Blot檢測

對凍存的細胞樣本和肌肉組織樣本進行，進行BCA蛋白定量，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上配制8%的凝膠，根據蛋白定量結果加樣本量，121 V恒壓電泳90 min。轉膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%BSA封閉1 h。1∶1000稀釋蛋白抗體（一抗），封閉后加入一抗4℃搖床過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜3次，每次10 min，再在封閉液中加入二抗(1∶5000-10000辣根過氧化物酶標記的抗鼠抗體)，室溫1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min。化學發光試劑顯色，曝光機中進行曝光。

1.2.4 統計學處理

所有統計數據均采用SPSS軟件ANOVA進行顯著性分析，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有明顯顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛水提物對C2C12細胞遷移率的影響

圖1 鐵皮石斛水提物對C2C12細胞遷移率的影響

C2C12細胞在經過不同濃度鐵皮石斛水提物2 h處理后，鐵皮石斛水提物（80 ug·mL-1）組的細胞遷移率明顯上升（圖1.F），與空白對照組相比有顯著性差異，差異具有統計學意義（圖1）。鐵皮石斛水提物40ug·mL-1及160 ug·mL-1組的細胞遷移率略高于空白對照組，但差異不明顯（圖1.D、H）。綜上所訴，鐵皮石斛水提物在處理細胞2小時對細胞的遷移效果有一定的促進效果，此效果與鐵皮石斛水提物的濃度有關。

圖2 鐵皮石斛提取物處理2 h后C2C12細胞中EGFR中蛋白表達的影響

2.2 鐵皮石斛水提物對C2C12細胞EGFR表達量的影響

EGFR是一種糖蛋白，屬于ErbB受體家族的一種，為酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。因此，我們利用蛋白免疫印跡法對C2C12細胞中EGFR蛋白表達進行分析[11]。

實驗結果表明，經鐵皮石斛提取物處理后C2C12細胞中EGFR與對照組相比有顯著上升(圖2)。這個結果說明，鐵皮石斛提取物能夠有效調控EGFR蛋白的表達，從而起到促進C2C12細胞增殖的作用。

2.3 鐵皮石斛水提物對骨骼肌組織EGFR表達量的影響

為了進一步研究鐵皮石斛水提物能否增加骨骼肌組織中EGFR表達水平，利用骨骼肌組織離體孵育實驗體系（圖3），我們用含有鐵皮石斛水提物的緩沖液對骨骼肌組織進行孵育處理，通過實驗，我們發現與對照組相比，骨骼肌組織經過鐵皮石斛水提物處理后其EGFR表達量顯著上調（圖4）。

3 討論與結論

圖3 骨骼肌組織離體孵育實驗體系示意圖

圖4 鐵皮石斛提取物處理后骨骼肌組織中EGFR中蛋白表達的影響

伴隨著全面健康熱潮，體育愛好者和廣大健身群體在從事體育鍛煉和運動的過程中很容易忽視對鍛煉的強度與時間的把控，不規范的運動方式及過度長時間體育運動都會導致的運動性疲勞和骨骼肌損傷，此類問題已經日益成為運動生理學、運動醫學以及運動訓練學界研究的熱點。同時，因為骨骼肌的疲勞和損傷表觀上無法準確評估和實施醫療對策，所以研究而的熱點也是一個難點，運動性疲勞及損傷問題主要以肌肉疲勞及損傷為主，而在體育運動中骨骼肌作為軀干和四肢的主要動員肌群，其疲勞以及損傷的問題極其常見，同時也非常關鍵。骨骼肌一旦發生了運動性疲勞和損傷，會造成人體機體的運動支持器官不能有效和穩定的支持其機能維持在正常水平上，嚴重影響了對象人群的生活質量和健康預期。特別是因疲勞形成損傷的肌肉組織如果不能得到有效的恢復，會直接導致肌肉收縮速度緩慢，效率降低，缺乏正常的伸展與收縮能力。這會造成從事運動人員的動作不規范，整體不協調不連貫，誘發肌肉二次損傷概率大大升高。同時，運動損傷所帶來的不適感與疼痛感也給人們日常生活和工作帶來了極大的不便，這也會直接挫傷廣大群眾參與大眾體育活動與全民健身的積極性和熱情。所以，除了積極普及大眾體育項目與指導群眾運動技能之外，通過有針對性的科學研究，利用各種有效手段及時補充損失的機能，使運動所帶來的骨骼肌損傷能夠快速恢復，增強體育運動的健康促進效果與質量，提高人民群眾的整體身體健康水平，已經成為國內外運動生理學和運動醫學學者與社會指導員們關注的焦點之一。近年來科學應用天然植物成分的功效性來預防骨骼肌疲勞、促進損傷恢復，增強肌肉力量和柔韌性，增加肌肉耐力，提高協調控制機體各運動部分的能力，從而使人民身體強健成為一個熱門課題。近些年，世界上很多科研人員和知名制藥企業都在努力嘗試研究開發具有抗疲勞、促損傷恢復以及抗衰老功效的藥物和保健食品，但目前尚未有特別有效的藥物問世。另一方面，傳統中藥越來越受重視，并且有許多藥物都表現出有良好的抗疲勞、促損傷恢復和抗衰老的效果。大部分的藥物都有抗氧化、促新生的成分，具有清除因疲勞或老化導致的代謝異常產生過量副產物自由基的功能[12]。

因此，在推進全民參與體育運動的大背景之下，針對肌肉疲勞和肌肉拉傷等常見的運動損傷形式，需要一種安全并有效的方法來緩解和抑制此類情況的發生。隨著經濟發展、生活水平的提高和老齡化社會的到來，亞健康問題越來越嚴重，人們對養生保健的關注度也在逐漸增加，對保健食品的需求也愈加旺盛[13,14]。現在，鐵皮石斛保健食品功能中以增強免疫和緩解體力疲勞進而擁有較高的知名度和市場占有率，得到消費者的普遍認可。深度研究鐵皮石斛功效機理，明確其功效機制，針對運動人群和亞健康人群的不同需求，開發出具有針對性的保健食品，可以開拓鐵皮石斛保健食品未來發展的新空間。

當前世界推崇綠色食品、綠色運動，提倡綠色健康的生活方式，但是運動所產生的肌肉損傷問題一直是人們不可回避的難題，本實驗明確一定濃度的鐵皮石斛水提物能夠上調C2C12細胞和肌肉組織中EGFR的表達水平，并能促進C2C12細胞增殖，這個研究發現在健康問題備受關注的現代，很可能成為解決運動引起的肌肉損傷問題的一個契機和重要線索[15-17]。

中醫藥越來越受到國際的普遍認可，而中醫藥關聯保健食品也必將成為未來國際市場的熱點。下一步，我們將繼續深入開展鐵皮石斛活性成分及相關功能的基礎研究，目標定位于開發出具有明確功效成分、確切功效靶點的相關產品，使鐵皮石斛相關保健產品得到越來越多國內外消費者的青睞。