基于質譜技術的“體外-體內”多維化學物質組逐層遞進關聯分析策略用于中藥體內藥效物質基礎研究＊

劉 舒，宋鳳瑞，皮子鳳，劉志強

（中國科學院長春應用化學研究所，吉林省中藥化學與質譜重點實驗室及化學生物學實驗室 長春 130022）

1 引言

中醫藥治療疾病具有整體協同作用的優勢和特色，在慢性疾病、代謝綜合性疾病等病理機制復雜的疾病治療中顯示出了獨特的優勢。然而，由于“中藥藥效物質基礎不清楚、作用機制不明晰”等問題的存在，致使中藥長期以來受到眾多質疑。其中，中藥體內藥效物質基礎不清楚是制約人們科學認識中藥的核心問題。

然而，中藥成分十分復雜，即使是單味藥，仍可能含有成千上萬種化學成分，并且，傳統中藥以口服用藥為主，首過效應的存在致使其進入體內的原型成分和代謝產物濃度均較低，加之內源性基質干擾嚴重，致使中藥體內微量和痕量未知新成分的快速精準辨識十分困難，而這些成分往往是發揮藥效的關鍵成分；此外，進入體內的中藥原型成分和代謝成分，并不一定都是效應成分，需要對其進行進一步的活性篩選和評價才能最終闡明中藥體內藥效物質，目前常用的活性篩選方法是基于分離得到單體成分的前提下進行的，不僅微量痕量成分的分離制備十分困難，而且分離得到的單體成分很多為非效應成分，耗時費力，致使中藥體內藥效成分的快速篩選成為中藥體內藥效物質研究的另一巨大挑戰。鑒于此，急需突破中藥體內藥效物質的高效發現技術，構建中藥體內藥效物質的快速發現和精準辨識方法，解決制約中藥體內藥效物質基礎研究的關鍵科學難題。

2 基于“體外-體內”多維化學物質組逐層遞進關聯分析策略的中藥體內藥效物質基礎研究思路

圖1 “體外-體內”多維化學物質組逐層遞進關聯分析的“四步法”研究思路

眾所周知，傳統中藥以口服用藥為主，其化學成分必然會受胃腸道酸堿性、腸道微生物及代謝酶等影響發生轉化，且吸收進入體內后，會在肝臟作用下發生進一步的代謝反應，使體內藥源性成分除原型成分外，還可能存在大量代謝產物。針對口服中藥這一特點，作者團隊提出了基于“體外-體內”多維化學物質組逐層遞進關聯分析策略的中藥體內藥效物質基礎研究思路，增強了分析靶向性，實現中藥體內藥效成分的快速發現和精準辨識。

具體闡述如下：①建立基于質譜特征診斷離子的中藥復雜體系化學成分結構精準表征方法，闡明中藥體外原型化學物質組；并以此為基礎，建立包含質譜特征診斷離子、分子量和色譜保留時間等信息的本地化學成分數據庫；②建立藥物體外腸內菌代謝和肝微粒體代謝研究模型，研究中藥的體外腸內菌代謝物質組和肝微粒代謝物質組，闡明各類成分（如皂苷、三萜、寡糖酯等）的代謝規律，并將體外代謝物質組及其特征代謝規律加入到本地化學成分數據庫，使數據庫信息進一步擴充；③基于已構建的本地化學成分數據庫，靶向分析在體糞便和肝臟中的藥源性成分，并將相關代謝產物信息加入到本地化學成分數據庫，數據庫信息得到最終完善；以此為指導，靶向篩選血液和靶器官中的藥源性成分，闡明體內化學物質組；④以體內化學物質組研究結果為指導，進行網絡藥理學分析（即靶向網絡藥理學分析），闡明作用于疾病靶點和通路的化學成分，并對預測的關鍵靶蛋白進行生物學驗證，最終明確中藥體內藥效物質基礎及其作用機制。并且，對于中藥復方體內藥效物質基礎研究，可以基于上述研究策略，進行“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復方成分”的逐層遞進分析，從而實現中藥復方體內藥效成分的精準辨識。

該研究策略充分考慮了中藥成分復雜、理化性質及含量差異懸殊、同分異構體多、代謝產物動態變化且未知成分多、標準品缺乏等特點，通過逐層遞進分析分解解析難度，由易到難，循序漸進，有目的性和導向性的解析體內化學物質組和體內藥效物質組，可以極大地提高復雜基質樣品中體內化學物質組和體內藥效物質組的發現準確度和效率，解決微量、未知、結構類似、動態變化的體內藥效成分快速發現和精準辨識難題（圖1）。

3 中藥復雜體系成分鑒定方法的建立及應用

中藥具有成分復雜、同分異構體多、未知成分繁多、標準品缺乏等特點，致使中藥成分的分析鑒定十分困難。為此，在體外原型化學物質組研究方面，作者研究團隊將色譜分離、數據采集、數據分析和質譜技術創新性融合，構建了中藥復雜體系化學成分分析方法。例如，針對中藥梔子體外化學物質組鑒定難題，作者研究團隊建立了多級分離結合特征診斷離子匹配的微量成分和同分異構體成分精準辨識方法，成功鑒定出了包括環烯醚萜類、黃酮類、三萜類、單萜類、二萜類及多酚類等在內的71種化學成分，并且利用離子淌度三級分離技術首次發現了梔子中4種新的西紅花苷-3和西紅花苷-4同分異構體[1]（圖2）。建立基于質譜診斷離子的“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復方成分”逐層遞進分析方法，對烏頭湯、復方夏連膠囊等進行了研究，獲得了其體外化學物質組[2,3]。在體外代謝物質組研究方面，利用體外腸內菌代謝和體外肝微粒體代謝模型，實現了藥物體外代謝物質組的分析和表征。例如，馮等研究表明，人參皂苷類成分在腸道菌群作用下主要產生去糖基化產物，生成更易吸收的弱極性成分。腸內菌代謝的主要產物在肝微粒體作用下，主要產生羥基化等氧化還原反應產物，初步闡明了人參皂苷I相代謝的循序漸進及系統性，可為后續的人參皂苷類成分的體內代謝研究提供重要參考[4]。在體內藥效成分研究方面，作者團隊建立了以入血成分為導向的靶向網絡藥理學分析方法，明確了烏頭湯治療佐劑型關節炎的主要活性成分為烏頭類生物堿、麻黃堿，以及甘草苷、芒柄花素、芍藥苷等成分[5]。復方夏連膠囊治療慢性萎縮性胃炎的主要活性成分為小檗堿、甘草酸、漢黃芩素及人參皂苷等9種成分[6]。

圖2 多級分離結合特征診斷離子匹配的梔子中微量成分和同分異構體成分分析

4 基于“體外-體內”多維化學物質組逐層遞進關聯分析策略的茯苓治療阿爾茲海默癥的體內藥效物質基礎研究

茯苓三萜酸類成分是茯苓中的主要活性成分之一，但其含量低、結構相似、同分異構體多、電離效率低，尤其是缺乏足夠的對照品，嚴重阻礙了茯苓三萜酸類成分的定性分析。基于此，首先，我們提出了一種超高效液相色譜-多維質譜法結合UNIFI軟件數據后處理技術的靶向數據分析策略，用于茯苓三萜酸類成分的快速定性分析，從茯苓中共鑒定出121種茯苓三萜酸類成分，以此作為茯苓三萜酸類成分的本地化學成分數據庫[7]。其次，選取特征性茯苓三萜酸類成分單體作為研究對象，利用體外大鼠腸內菌代謝和大鼠肝微粒體代謝模型，研究了茯苓三萜類成分的腸內菌及肝微粒代謝規律，發現茯苓三萜類成分在腸內菌作用下基本不發生代謝反應，而是直接通過小腸上皮細胞吸收進入體內；而茯苓三萜酸類成分在肝微粒體作用下主要發生氧化反應，包括單加氧和雙加氧的代謝反應，以此規律為指導，推測其它茯苓三萜酸類成分在體內可能產生的代謝產物，將其信息加入到本地化學成分數據庫。以此數據庫為依托，對吸收進入體內的茯苓三萜酸類成分進行篩選和鑒定，共鑒定出62種原型成分和59種代謝物。最后，以入血成分為指導，通過靶向網絡藥理學分析方法，篩選出治療阿爾茨海默病的有效吸收成分，初步闡明了茯苓治療阿爾茲海默癥的體內藥效物質基礎[8]。

5 總結與展望

中醫藥作為具有豐富科學內涵的復雜體系，在多成分多靶點協同整合治療疾病方面體現出了其獨特的優勢，然而，也由于其體系的復雜性，給其藥效物質基礎研究帶來的極大的挑戰，致使多數中藥治療疾病的藥效物質基礎尚不十分清楚，大大限制了人們對中藥治療疾病的科學認識。因此，中醫藥的傳承和發展，必須借助不斷發展的現代科學技術建立適合中醫藥復雜體系的創新方法，來深入研究中藥的物質組成和結構，并在此基礎上明確其有效成分、闡明其物質基礎和作用機制，才能使其在世界范圍被認可、接受，才能從根本上保證中藥質量的穩定可控，促進中藥產業的健康發展。近年來，中藥學者對于中藥藥效物質基礎研究日益重視，新的研究思路、研究方法和先進技術手段被應用于中藥藥效物質基礎研究中，取得了重大突破。未來，隨著分析檢測技術、生物信息學技術等的發展，將會產生更多的新思路、新方法，用于解決中藥藥效物質基礎研究中存在的技術瓶頸問題，從而促進中醫藥現代化發展。