細胞色素P450酶介導的中藥代謝激活與毒性研究進展＊

吳敬敬，馬虹瑩，王丹丹，葛廣波＊＊，楊 凌＊＊

（1.大連醫科大學藥學院 大連 116044；2.上海中醫藥大學交叉科學研究院 上海 201203）

中草藥以其獨特的療效在中國乃至世界的醫療保障體系中占有非常重要的地位。據世界衛生組織統計，大約世界人口的80%都在使用草藥作為治療手段[1]。然而，近年來，有關中草藥誘發毒性的報道日趨增多，使中草藥安全性問題成為醫患及社會共同關注的焦點[2-4]。中草藥毒性主要分為直接毒性和草藥-藥物相互作用兩大類。藥物代謝是人體防御外來物侵襲的重要機制。一般而言，外源性物質通過代謝反應會使母體化合物的生物活性或毒性有所降低，所以被認為是減毒的過程。然而，也有相當一部分藥物分子經代謝會生成毒性更強的代謝物。在有些情況下，甚至會在代謝酶的催化作用下產生親電反應活性代謝產物，這個過程被稱為代謝激活（metabolic activation）或生物激活（bioactivation）（圖1）。目前報道的絕大多數的代謝激活是由細胞色素P450酶所介導的，僅有少數由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶、磺酸化酶、甲基轉移酶等介導[5-7]。代謝激活過程中產生的具有親電活性的代謝中間體，一方面能夠和細胞內的生物大分子，如蛋白質或核酸，發生共價結合而誘發毒性；另一方面還會共價修飾藥物代謝酶，使其產生不可逆性抑制，從而誘發嚴重的藥物-藥物相互作用[8,9]。代謝激活是藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）和上市藥物被撤銷的主要原因[10-13]。統計表明，在美國已撤市的藥物中有64%的藥物經歷了代謝激活過程[14,15]。目前，代謝激活已經成為了國內外中草藥毒性研究領域的熱點，尤其是近期馬兜鈴酸致肝癌的相關性研究使得中藥安全性再度成為國內外關注的熱點問題[16]。

圖1 代謝激活的基本過程模式圖

表1 易被P450酶代謝激活的基團和相應產生的活性代謝中間體

早在2005年，Kalgutkar等人根據大量的實驗結果總結了容易被代謝激活的毒性基團[17]（表1）。其中主要包括：芳香胺、酰肼類、芳香硝基物、含氮雜環化合物、對苯二酚、亞甲二氧基苯、呋喃等。Samuel等人發現一個含有苯氧基的候選藥物在藥物代謝酶的催化作用下會發生很強的代謝激活生成臨醌親電活性中間體，并對其作了一系列的結構修飾，最終大大降低了其代謝激活的程度[18]。Tang等人發現含有二氨基吡啶基團的化合物很容易經歷代謝激活過程，從而形成醌亞胺親電活性中間體。經過大量的化學修飾改造發現用N-甲基或者氧替換吡啶環上的2-NH基團能夠在不影響藥效的情況下消除代謝激活的現象[19]。本文將針對P450酶代謝激活的不同中藥化合物及其相關毒性進行綜述。

1 吡咯里西啶類

圖2 吡咯里西啶生物堿的代謝激活過程

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類天然有毒生物堿，據統計大約有400種結構得到確證的PAs，廣泛存在于6000種有花植物中。這些植物的95%以上主要集中于以下4個科中即菊科（Asteraceae）的千里光屬（Senecio L.）、橐吾屬（Ligularia Cass）、澤蘭屬（Eupatorium）和蜂斗菜屬（Petasites）；紫草科（Boraginaceae）的天芥菜屬（Heliotropium）、琉璃草屬（Cynoglossum）、紫草屬（Lithospermum）和聚合草屬（Symphytum）；豆科（Leguminosae）的豬屎豆屬（Crotalaria）；蘭 科（Orchidaceae）的 羊 耳 蒜 屬（Liparis）。吡咯里西啶生物堿的代謝激活反應被認為是其毒性產生的一個非常重要的誘因，其經由P450代謝轉化形成吡咯-蛋白質加合物，從而誘發肝毒性，這些加合物可作為評價PAs毒性的生物標志物[20]。

肝臟中多種藥物代謝酶都參與了吡咯里西啶生物堿的代謝反應，其中細胞色素P450參與的代謝激活反應被認為是其致毒的一個關鍵的步驟[21]。吡咯里西啶類生物堿的發現解釋了千里光、款冬花等中藥發生肝毒性的原因[22]。不同的PAs毒性差別很大。PAs是千里光次堿酸的單酯或二酯，根據堿基類型可分為3種類型：倒千里光裂堿型（retronecine-type），奧索千里光裂堿型（otonecine-type）和闊葉千里光裂堿型（platynecine-type）。其中，毒性最弱的是闊葉千里光裂堿型的PAs[20]，具有肝毒性的PAs含有不飽和的堿基[21]。PAs通過P450酶代謝轉化形成吡咯-蛋白質加合物的活性中間體，從而誘發肝毒性（圖2）。已有研究表明，僅有CYP3A4和CYP3A5兩種P450亞型酶能夠激活奧索千里光裂堿型PA；相比之下，CYP1A1，1A2，2A6，3A4，3A5，2B6，2C9，2C19，2D6，2E1等10余種P450亞型酶均能夠激活倒千里光裂堿型PA，并且參與其代謝激活的P450亞型酶的貢獻也存在很大差異[21]。此外，值得注意的是，N-葡萄糖醛酸化是大多數吡咯里西啶生物堿的一條共有的代謝途徑，且主要由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉移酶（UGT）1A4介導。已有研究表明，單獨使用千里光寧（senecionine）并不能誘發人肝細胞毒性，而當UGT1A4活性受到蕃麻皂抑制后，肝細胞毒性迅速表現出來，這表明葡糖醛酸化可能是人體抵御其毒性一道重要防御機制[23,24]。

2 硝基菲類

馬兜鈴酸（aristolochic acid）屬硝基菲類衍生物，是關木通、廣防己等馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的有效成分，曾在臨床上用于鎮痛消炎、祛痰利尿以及感染性疾病和癌癥的輔助用藥等，從結構上分為馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II，均含有硝基芳烴結構[25]。已有研究表明，馬兜鈴酸結構中的硝基基團為主要的毒性基團，甲基和羥基的存在可以進一步增強其毒性[26,27]。馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II能夠在CYP1A1/2等多種代謝酶的作用下，硝基基團被還原成環狀的成氮翁離子（nitrenium），后者可以與DNA，尤其是鳥嘌呤和腺嘌呤的氨基基團，或者蛋白質發生共價結合，形成加合物，從而導致腎小管上皮細胞凋亡和壞死[28-30]。1993年，比利時學者在Lancet雜志上首次報道了含有廣防己和厚樸的減肥丸可引起快速進行性間質性腎纖維化，并稱此腎病為中草藥腎病[31]。1999年英國柳葉刀又報道了兩名婦女因服用含關木通的草藥茶治療濕疹導致晚期腎衰竭事件[32]。2000年6月美國聯邦食品藥物管理局（FDA）采取了嚴厲措施，對含馬兜鈴酸成分的藥材和成藥限制使用和進口。隨后加拿大、英國、西班牙、馬來西亞等國家也發布了進口和銷售含馬兜鈴中藥的禁令。國家藥品和監督管理局于2003年4月1日印發了取消關木通藥用標識的通知。

表2 吡咯里西啶類中草藥的代謝激活實例

表3 硝基菲類中草藥的代謝激活實例

表4 亞甲二氧基苯類中草藥的代謝激活實例

續表

圖3 EEA的代謝激活過程

3 亞甲二氧基苯

天然產物中廣泛分布有亞甲二氧基苯化合物[33]。例如，體外研究報道證實紫堇靈（corynoline）[34]，五味子酯甲（schisantherin A）[35]和黃連堿（hydrastine）[36]等含有亞甲二氧基苯結構的天然產物均對P450酶表現出NADPH和時間依賴性的抑制作用。那可丁（Noscapine）是從罌粟科植物中分離得到的一種芐基異喹啉類生物堿，長期以來在臨床上用作鎮咳藥[37]。該化合物含有亞甲二氧基苯結構。已有研究表明，那可丁對CYP3A4和CYP2C9表現出NADPH和時間依賴性的抑制作用，這可能是臨床上發生那可丁-華法林聯合用藥所致的華法林不良反應的重要機制[38]。黃樟油精（Safrole）是黃樟、肉桂和胡椒等植物的主要成分，其已經被證明有肝毒性和肝致癌性的潛在風險[39]。長期使用黃樟油精1年或更長時間會導致大鼠和小鼠肝癌。黃樟油精在體內主要由CYP2A6，CYP2C9，CYP2D6和CYP2E1等P450酶生成1'-羥基黃樟油精，然后進一步與磺基轉移酶結合形成可致癌作用的綴合物[40,41]。此外，卡瓦（Kava）是一種用于治療焦慮和失眠的草藥，醉人素（Methysticin）和二氫麻醉椒素（dihydromethysticin）是其中含有亞甲二氧基苯結構的兩種卡瓦內酯，可經由P450酶介導的O-脫烷基化反應形成鄰苯二酚，并進一步氧化生成親電子的鄰醌，后者會消耗細胞內的谷胱甘肽，這可能是卡瓦導致肝毒性的潛在機制[42,43]。

4 呋喃類

越來越多的證據表明含有共同呋喃環的化合物與藥物小分子的毒性和與藥代動力學相互作用有關。石蠶是一種具有利膽和抗菌作用的民間藥物，石蠶堿（Teucrin A）被認為是石蠶造成肝毒性的罪魁禍首，該化合物的呋喃環經CYP3A4介導的氧化反應生成反應性環氧化物，進而與環氧化物羥化酶形成加合物，導致自身抗體的形成，并誘發免疫反應[44]。8-甲氧基補骨脂素可聯合長波長紫外線治療銀屑病，有研究表明8-MOP可經由CYP2A6和CYP2B1代謝激活生成活性中間體，進一步與GSH或大分子共價結合形成呋喃環氧化物[45,46]。檸檬苦素（Limonin），是一種從許多柑橘類水果如吳茱萸果實中提取的檸檬苦素衍生物，以NADPH-和時間依賴性方式使CYP3A4失活。推測呋喃環的生物活化形成的反應性中間體是檸檬苦素使CYP3A4失活的主要原因[47]。薄荷呋喃（Menthofuran），一種天然存在的肝毒素，可被P450酶氧化為反應性親電子體，這與薄荷呋喃肝臟毒性機制相關。參與這一過程的CYP亞型包括CYP1A2，CYP2E1、CYP2C19和CYP2A6[48]。薄荷呋喃也是胡薄荷酮（pulegone）的代謝產物，這可能也是胡薄荷酮產生毒性的原因之一[49]。

表5 呋喃類中草藥的代謝激活實例

表6 烯烴類中草藥的代謝激活實例

表7 蒽醌類中草藥的代謝激活實例

表8 吲哚類中草藥的代謝激活實例

此外，呋喃型化合物8-表黃藥子素E乙酸酯（EEA）是中藥黃藥子的主要組成成分。已有研究發現，給小鼠喂服EEA可引發急性肝毒性。研究者進一步通過體內外的代謝激活實驗發現CYP3A4是EEA的主要代謝酶，催化EEA生成烯二醇活性中間體（圖3），這可能是其導致肝毒性的主要發生機理[50,51]。此外，活性代謝產物生成后，一方面可以共價修飾P450酶，人血清白蛋白等大分子蛋白，產生抗原-抗體反應進而引發免疫毒性；另一方面也可能會進攻DNA后產生DNA加合物，進而引發遺傳毒性。

5 烯烴類

烯烴是藥物中典型的毒素。草蒿素（Estragole）和甲基丁香酚（methyleugenol）存在于多種中草藥中，如肉豆蔻，肉桂，龍蒿，羅勒，茴香，茴香等。已有研究表明草蒿素具有遺傳毒性和致癌性，且與其生物轉化相關。草蒿素通過CYP1A2和CYP2A6代謝形成1'-羥基草蒿素[52]，后者進一步發生硫酸化反應，形成1'-磺氧基草蒿素，這是一種潛在的致癌物。失去硫酸基團的同時，生成的草蒿素碳正離子能夠與DNA（主要是脫氧鳥苷）生成加合物[53]。與草蒿素相似，甲基丁香酚在體內經由CYP1A2和CYP2C9代謝生成1'-羥甲基丁烯醇，后者是一種致癌代謝物，可促進小鼠和大鼠腫瘤的形成[54]。此外，大蒜素（Allicin）是一種從大蒜中分離出來的有機硫化合物，據報道它具有抗細菌和抗真菌作用。該化合物可以進一步轉化為二烯丙基硫醚化合物，然后通過CYP2E1將其轉化為二烯丙基砜，二烯丙基砜通過生物轉化形成活性單烯丙基環氧化物，進一步與CYP2E1形成加合物，最終導致不可逆的酶抑制作用，從而滅活CYP2E1的活性[55-57]。

6 蒽醌類

何首烏是一種常用中藥材，其引發的DILI不良反應報道逐年增多[58,59]。何首烏引發的肝損傷占全部藥物性肝損傷病例的3.24%[60]。2012年9月美國國家醫學圖書館發布的LiverTox數據庫中收錄600余種具有肝毒性的西藥和中草藥，其中何首烏作為一個專題被收錄，較系統綜述了何首烏及其制劑肝損傷的國際報道[61]；國家藥品不良反應監測中心2014年7月19日第61期藥品不良反應信息通報特別報道了口服何首烏及其成方制劑存在肝損傷風險[62]。已有研究者對何首烏的部分主要單體成分進行了體外毒性評價，其結果雖然顯示其主要成分蒽醌類化合物，如大黃素、大黃酸、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素和沒食子酸會對肝細胞產生損傷[59,63]。其中，大黃素在體內主要經由CYP1A2，CYP2C19和CYP3A4代謝生成氧化產物，大黃素及其氧化產物均能與谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸等生物硫醇形成加合物，這可能是其誘發肝毒性的主要機制[64]。

7 吲哚類

許多含有吲哚基團的藥物分子被證明通過生物活化形成醌亞胺中間體。吳茱萸次堿（Rutaecarpine）和吳茱萸堿（evodiamine）是從吳茱萸中分離得到的兩種吲哚-喹唑啉類生物堿。吳茱萸次堿對CYP3A4可產生NADPH-和時間依賴性的抑制作用，發揮其生物活性。相反，吳茱萸堿雖然與吳茱萸次堿具有相似的結構，但卻不能滅活CYP3A4[47]。

8 展望

綜上所述，代謝激活可作為引發中草藥毒性的重要起始事件。早期篩查和評價中藥組份的代謝激活潛能是中藥毒性評價的重要組成部分，可借助質譜技術，采用產物離子掃描、中性丟失掃描等質譜手段，結合Lightsight等先進的質譜解析軟件，監測反應性代謝物及其加合物結合物的特征質譜信號，篩查毒性成分；進而對其肝毒性等下游毒性事件進行驗證評價。目前，國際毒理學界提出了有害結局路徑（Adverse Outcome Pathway，AOP）這一框架，該框架是目前國際上公認的毒理學評價體系，其核心是在系統生物學指導下，基于毒物作用模式（Mode of Action,MoA）[65]，將分子起始事件（Molecular Initiating Events，MIEs）至 有 害 結 局（Adverse Outcome，AO）中所有與毒性相關的關鍵事件（Key Events，KEs）的信息逐層整合并構建在不同層面的生物體系上，如分子、亞細胞器、細胞、組織、器官等水平，進而用于毒物的風險評估與分類[66,67]。在AOP框架下，毒性評價可借助不同種類的細胞/組織/動物等體內外模型，并結合各種檢測和評價手段，取決于應用目的的不同。毒性相關的分子改變、形態結構改變、功能改變等都須與起始事件及一系列中間事件，包括分子機制，可以依照特定的體系或應用目標邏輯性關聯起來。該框架可在評價化合物是否有害的同時對化合物進行分類，還可依據化合物的結構特征和理化性質以及作用模式和機制預估新化合物的毒性及潛在機制。