應用基因本體數據庫分析中波紫外線對HaCaT細胞microRNA表達的影響

楊 玲，許 速，胡中華

皮膚在接受一定累積劑量的紫外線輻射后可發生一系列細胞內變化，如細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS)和氧化應激標志物（8-氧-鳥核苷、異前列烷、硝基酪氨酸等）水平升高、細胞核染色體斷裂和線粒體DNA突變等，從而激活與炎癥或腫瘤相關的信號轉導途徑，并進一步調節其下游基因的表達，最終啟動皮膚的損傷、衰老甚至癌變等過程[1]。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）逐漸引起各相關領域的重視，許多研究表明miRNA在細胞的增殖、分化與凋亡、生物體的生長發育、免疫反應以及疾病發生發展中發揮重要作用[2]。為探討miRNA在紫外線引起皮膚光損傷機制中的作用，本研究利用生物芯片技術檢測中波紫外線（ultraviolet B，UVB）輻照人角質形成細胞的miRNA表達，并應用基因本體（gene ontology，GO）數據庫分析差異miRNAs的靶基因功能，以期從miRNA組學水平探討UVB致皮膚光損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

永生化人角質形成細胞（HaCaT細胞，昆明懷天科技有限公司）。miRNA抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），miRNA標記和雜交試劑盒、基因表達洗滌緩沖液（美國Agilent公司）；Agilent Bioanalyzer 2100電泳分析儀、Nano Drop ND-2000分光光度計、滾動雜交爐、微陣列掃描儀（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 HaCaT細胞以DMEM（高糖）培養基調整濃度為105/ml～106/ml，接種于6孔培養板中繼續培養24 h，待其貼壁后用于后續觀察及實驗檢測。將亞融合狀態的細胞分為對照組和照光組，輻照前各孔細胞均棄去培養基，加磷酸鹽緩沖液（PBS）覆蓋，輻照后棄去PBS并加相應培養基繼續培養。根據UVB照射劑量對實驗細胞分組如下：①未處理組；②100 mJ/cm2UVB組；③200 mJ/cm2UVB組；④400 mJ/cm2UVB組，并設定12 h、24 h為檢測時相點。

1.2.2 miRNA的抽提、純化與標記 根據miRNA抽提試劑盒的標準操作流程進行樣品的總RNA抽提，經電泳質檢合格后備用。實驗樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的試劑盒，按照標準操作流程對樣品miRNA進行熒光標記和雜交。雜交條件如下：在滾動雜交爐中，55℃ 20 r/min，滾動雜交20 h，雜交完成后洗片。按上述流程共完成7張人miRNA （8×60K）V21.0芯片的處理。

1.2.3 芯片掃描 應用Agilent微陣列掃描儀對芯片進行掃描，掃描分辨率（scan resolution）=3 μm。 用 Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數據，最后采用R語言程序包AgiMicroRna進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.2.4 差異miRNAs篩選 選擇倍數差異（fold change，fc）和探針檢出標記（ fl ag）兩個參數設定篩選閾值，每個處理組分別與對照組相比較進行差異miRNA篩選，且至少一組內不出現fl ag 為A（A 表示該探針信號值與背景信號值無明顯差異，P 表示該探針信號值與背景信號值有顯著差異）的探針，若設定篩選閾值為fc2，則兩組比較的倍數值為≥2 倍（上調差異miRNA）或≤0.5 倍（下調差異miRNA），將上述數據經標準化處理后繪制散點圖。若設定篩選閾值為fc3，篩選表達變化更有顯著的差異miRNA，則兩組比較的倍數值為≥3 倍（上調差異miRNA）或≤0.33 倍（下調差異miRNA），即差異miRNA表達更為顯著，以上篩選結果可在miRBase序列數據庫（網址http://mirbase.org/）中查詢其相關信息。

1.2.5 差異miRNA的靶基因預測 采用Target Scan7.0進行靶基因預測，預測閾值為保留total context ++ score＜-0.2的結果，并進行基于GO數據庫的靶基因功能的富集分析。

1.2.6 GO富集分析 采取的方法是 fi sher精確檢驗，數據包是clusterPro fi ler，來自R/bioconductor，挑選的標準是落在某個term/GO 上差異的基因數目≥2且P＜0.05，并按照富集因子（enrich factor）的值從大小降序排列，取前30個結果繪圖。

2 結果

2.1 UVB處理HaCaT細胞的miRNA表達

差異倍數fc是由各處理組與對照組信號值比較所得，首先設定篩選閾值為fc2，圖1為100 mJ/cm2、200 mJ/cm2和400 mJ/cm2UVB處理HaCaT細胞12 h和24 h后的差異miRNA表達情況，其中上調表達miRNA為≥2 倍，下調表達miRNA為≤0.5 倍。圖1提示不同劑量UVB處理HaCaT細胞后均出現差異miRNA表達，其中400 mJ/cm2UVB處理后的HaCaT細胞差異表達的miRNA最為明顯。

圖1 UVB處理HaCaT細胞的miRNA表達

圖2為fc閾值下的差異miRNA散點圖分布。x軸表示該探針集在對照組樣本芯片中標準化后的信號值，y軸表示該探針集在處理組樣本芯片中標準化后的信號值，圖中每一個點代表芯片上的一個探針集，落在圖形中y=x直線上的點，代表該探針在兩組樣本內的信號值無差異，落在圖形中y=x直線兩側有顏色區域的點，代表該探針在兩組樣本內的信號值有差異，紅色點代表上調表達的差異miRNA，藍色點代表下調表達的差異miRNA。圖2提示各處理組和對照組數據總體分布比較集中，信號值分布與圖1一致。

根據圖1和圖2提示，400 mJ/cm2UVB處理組的差異miRNA表達最為顯著，將該組（包括12 h和24 h）實驗數據設定篩選閾值為fc3，篩選表達變化更為顯著的差異miRNA，即兩組比較的倍數值為≥3 倍（上調差異miRNA）或≤0.33 倍（下調差異miRNA），具體見表1。

2.2 差異miRNA的靶基因功能分析

主要針對400 mJ/cm2UVB組的差異miRNA進行靶基因預測及GO富集分析 根據富集因子（enrich factor）的值從大小降序排列，并進行分析（圖3）。圖3提示部分靶基因功能涉及T淋巴細胞介導的細胞毒作用、T淋巴細胞耐受、B淋巴細胞分化、自然殺傷細胞增殖、樹突細胞抗原處理提呈、免疫球蛋白產生以及中性粒細胞穩態等。

表1 400 mJ/cm2 UVB處理細胞后表達變化顯著的差異miRNA

圖2 UVB處理HaCaT細胞的差異miRNA信號值分布圖

3 討論

miRNA屬于非編碼RNA的一類，生物信息學預測每個miRNA均有眾多的靶基因，而每個基因的mRNA又有可能受到多個miRNAs的調控，由此構成復雜調控網絡的理論基礎[3]。一般認為其對靶基因的調控主要發生在翻譯水平，影響基因表達的機制是miRNA與靶基因mRNA的3′端非翻譯區（UTR）不完全互補結合，影響mRNA的成熟、轉運及穩定性，或直接調控翻譯過程，從而調節蛋白質的表達水平[4]。

圖3 400 mJ/cm2 UVB處理組差異miRNA靶基因功能的GO富集

針對皮膚光損傷的機制研究多集中于炎性因子或炎癥遞質參與的信號通路，為了探討其miRNA調控機制，本研究以不同強度UVB輻照HaCaT細胞，在12 h和24 h檢測細胞miRNA的表達，發現不同強度UVB作用后的不同時間點HaCaT細胞均有明顯的miRNA差異表達，且以高能量強度UVB條件下變化最為顯著。說明隨著UVB強度及時間的變化，有越來越多的miRNA參與到UVB對細胞機能影響的調控中。該結果與既往研究基本一致[5]，可為后續實驗提供理論基礎。進一步設定更為嚴格的fc3閾值篩選出9個表達變化明顯的miRNAs，其中上調表達的為miR-8063、miR-1273f、miR-4497、miR-4778-5p和miR-6510-5p，下調表達的為miR-1973、miR-5100、miR-205-3p和miR-4485-3p。查閱相關文獻發現，上述miRNAs有的參與了炎癥的發生、發展或轉歸過程，如miR-8063在感染（如肺部感染、皮膚感染等）引起的敗血癥患者血清中均有差異表達，并對判斷疾病的預后有一定的提示作用[6]；miR-6510-5p在銀屑病皮損中的差異表達提示其參與銀屑病發生、發展調控[7]。其他的miRNAs則集中于腫瘤研究領域，如Reshmi等[8]利用一種新的計算工具“Mpred”鑒定并驗證了miR-1273f序列在宮頸癌組織中的表達，提出其可能在腫瘤發生發展中起作用的觀點；Jima等[9]對比了miR-4497和miR-4485-3p在惡性B淋巴細胞和正常細胞中的表達情況，發現二者在惡性B淋巴細胞中均有差異性表達；miR-4778-5p在乳腺腫瘤組織中存在差異表達[10]、miR-1973在兒童急性淋巴細胞性白血病中存在差異表達[11]、miR-205-3p在宮頸癌和鼻咽癌中存在差異表達[12,13]，以上均提示這些miRNAs不同程度地參與了腫瘤的發病機制。此外，研究還發現，miR-5100在干燥綜合征患者的唾液腺中差異表達[14]，推測其與機體的自身免疫調節相關。鑒于皮膚作為人體與外界環境的第一道屏障，且皮膚屬于人體特殊的免疫器官，因而推測上述miRNAs在UVB誘導的皮膚致炎、致瘤以及免疫應答等過程中也具有重要的調控作用，并提示其可能是UVB致角質形成細胞病變的機制之一，值得進一步研究和探索。

GO是一個在生物信息學領域中廣泛使用的本體，用于提供一個可具代表性的規范化的基因和基因產物特性的術語描繪或詞義解釋的工作平臺，其涉及的基因和基因產物涵蓋生物學的三個方面：細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）。通過將差異基因做GO富集分析，可以把基因按照不同的功能進行歸類，并對基因進行注釋和分類，從而為繼續進行通路分析打下基礎[15]。本實驗應用GO數據庫對UVB誘導的差異表達miRNA的靶基因進行功能富集分析和分類，發現一部分差異基因的功能涉及T淋巴細胞介導的細胞毒作用、T淋巴細胞耐受、B淋巴細胞分化、自然殺傷細胞增殖、樹突細胞抗原處理提呈、免疫球蛋白產生以及中性粒細胞穩態等方面，進一步說明UVB誘導的角質形成細胞差異miRNA的靶基因直接或間接參與了機體的體液免疫和細胞免疫過程，并最終調控致炎或致瘤的病理過程。

綜上所述，本研究利用miRNA 表達譜芯片篩選了UVB輻照HaCaT細胞的差異miRNA，并應用GO數據庫分析了UVB致角質形成細胞損傷過程中可能起顯著作用的靶基因功能，為UVB致皮膚病變的機制研究提供了一些理論基礎。但本研究尚處于初步探索階段，還存在一些不足之處：其一，HaCaT細胞是經特殊培養條件誘導后永生化的細胞株，從基因調節方面看這種細胞與正常角質形成細胞相比有一定的差別，由此得到的實驗結果推導延伸至正常表皮細胞，其準確性及代表性有所偏差，下一步可利用原代培養的角質形成細胞驗證上述結果的可信度。其二，miRNA參與細胞的基因調控過程,涉及從基因表達到核酸轉錄再到蛋白質翻譯直至產生生物學效應等一系列復雜的中間環節，期間的影響因素錯綜復雜。本研究應用GO數據庫對差異miRNA的靶基因功能進行了初步分析，所涉及的靶基因功能較為寬泛，下一步實驗研究可選定某幾個miRNA片段與細胞生物學效應相關性進行研究，從而為UVB損傷皮膚角質形成細胞的HaCaT細胞的miRNA調控機制積累更有意義的結論。