絞股藍(lán)皂苷類成分的超高效液相色譜指紋圖譜研究

黃盼盼 ，馬臨科 ，唐登峰 ，趙維良 △

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052）

絞股藍(lán)Gynostemma pentaphylum（Thunb.）Mak.是葫蘆科Cucurbitaceae絞股藍(lán)屬Gynostemma的干燥地上部分，產(chǎn)于我國陜西南部和長江以南各省區(qū)，生于山坡疏林、灌叢中或路旁草叢中，本種入藥，有消炎解毒、止咳祛痰的功效［1］。其藥用成分主要為皂苷類和黃酮類物質(zhì)，以及氨基酸和多糖類等成分，其中絞股藍(lán)皂苷有抗疲勞、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、增強(qiáng)免疫力等多種生理活性［2-5］。目前，關(guān)于絞股藍(lán)藥材皂苷類物質(zhì)的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜尚未見報(bào)道。本研究中建立了UPLC絞股藍(lán)皂苷類物質(zhì)的指紋圖譜，并對(duì)浙江、四川、陜西和湖南4個(gè)產(chǎn)地的絞股藍(lán)藥材進(jìn)行比較分析，為絞股藍(lán)藥材及其飲片的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為其產(chǎn)地研究提供了研究思路。

1 儀器與試藥

儀器：ACQUITY H-Class型超高效液相色譜儀（包括四元溶劑管理器、PDA檢測(cè)器，上海沃特世科技公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（美國Millipore公司）；Elmasonic P 300型超聲波清洗器（德國Elma公司）；XPE205型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Minispin 12 000轉(zhuǎn)離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

試藥：絞股藍(lán)藥材購于浙江武義壽仙谷藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院主任中藥師郭增喜鑒定為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.的干燥地上部分，采收于2017年7月或9月（S2于9月），詳見表1。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，均購于Merck公司；水為超純水。

表1 絞股藍(lán)藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC 分析

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，程序見表 2；流速：0.2 mL ／min；檢測(cè)波長：203 nm，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL。吸取S3批制備的供試品溶液2 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫表

圖1 超高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取絞股藍(lán)干燥地上部分粉末（過4號(hào)篩）1.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲處理（功率 250 W，80 kHz）30 min，放置至室溫，用 70%甲醇補(bǔ)足丟失質(zhì)量，取2 mL供試品上清液，以轉(zhuǎn)速為13 000 r／min 離心 5 min，取上清液用 0.22 μm 微孔過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取S3批供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，選取S峰作為參照峰，計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.23%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為2.12%（n＝6），表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取S3批供試品溶液，按擬訂色譜條件在 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，以 S 峰作為參照峰計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為1.01%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為1.43%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S3批絞股藍(lán)藥材，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.10%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為 1.29%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.2 指紋圖譜分析

皂苷類成分指紋圖譜的建立：取S1-S16批樣品，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，將所得色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版（以下簡稱2012年版評(píng)價(jià)系統(tǒng)）進(jìn)行分析，選擇S1批絞股藍(lán)藥材作為參照?qǐng)D譜，其指紋圖譜見圖2。根據(jù)以上分析結(jié)果，取S1-S10批絞股藍(lán)藥材作為模板藥材建立指紋圖譜，選擇S1批作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行峰匹配，建立的指紋圖譜見圖3，多點(diǎn)校正后經(jīng)自動(dòng)匹配生成的對(duì)照指紋圖譜見圖4。

圖2 16批樣品指紋圖譜

圖3 S1-S10批指紋圖譜

圖4 S1-S10批對(duì)照指紋圖譜

特征指紋峰的標(biāo)定：根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定特征指紋峰，對(duì)模板S1-S10批絞股藍(lán)UPLC測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)9個(gè)特征峰為S1-S10批絞股藍(lán)藥材共有的，因此確定這9個(gè)峰為特征指紋峰，計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果見表3。

相似度評(píng)價(jià)：2012版評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，對(duì)16批絞股藍(lán)藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)分析，其中以S1-S10批作為模板藥材建立指紋圖譜，生成對(duì)照?qǐng)D譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，采用S1批樣品色譜圖作為參照?qǐng)D譜。其中，S1-S10批絞股藍(lán)藥材的UPLC指紋圖譜見圖3，多點(diǎn)校正后經(jīng)自動(dòng)匹配生成的對(duì)照指紋圖譜見圖4。結(jié)果16批絞股藍(lán)藥材相對(duì)于對(duì)照?qǐng)D譜的相似度見表4。

表3 S1-S10批絞股藍(lán)指紋圖譜中共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積

表4 絞股藍(lán)指紋圖譜相似度結(jié)果

3 討論

3.1 UPLC分析優(yōu)勢(shì)

絞股藍(lán)藥材皂苷類成分復(fù)雜，HPLC分析需要較長的分析時(shí)間（70 ～80 min）才能獲得較理想的分離效果［5］。UPLC分析僅需30 min且分離情況理想，在填補(bǔ)了UPLC建立絞股藍(lán)藥材指紋圖譜的空白的同時(shí)，分離效果上也比已報(bào)道絞股藍(lán)藥材的研究有了提高［6］。

3.2 色譜條件考察

考察了不同濃度溶劑甲醇（50%，70%）、不同溶劑體積（25 mL和50 mL）、不同提取方法（超聲、回流）和提取時(shí)間（30 min，45 min，60 min）的影響［7-8］，結(jié)果以25 mL甲醇超聲提取30min的提取效果最好。

考察不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸、甲醇 -0.1 磷酸、乙腈 -水、乙腈 -0.4% 磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、檢測(cè)波長（203 nm和254 nm）和不同流速的影響。結(jié)果顯示，乙腈-水的洗脫能力較強(qiáng)且分離度、峰形較好，檢測(cè)波長為203 nm，柱溫為30℃，流速為0.2 mL／min時(shí)，色譜峰基線平穩(wěn)、分離度好，可更好分離絞股藍(lán)皂苷各成分，因此采用梯度洗脫方式進(jìn)行分析。

3.3 不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材相似度存在差異

浙江、四川和湖南綏寧縣鵝公嶺鄉(xiāng)的藥材相似度均在0.88以上，而陜西和湖南綏寧朝儀鄉(xiāng)的相似度較低，只有0.55～0.75，說明浙江產(chǎn)絞股藍(lán)和四川、湖南綏寧縣鵝公嶺鄉(xiāng)產(chǎn)絞股藍(lán)基本一致，而陜西和湖南綏寧朝儀鄉(xiāng)絞股藍(lán)相似度較低。絞股藍(lán)的產(chǎn)地差異不僅存在于省份之間，也存在于鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間［9-14］。

3.4 研究價(jià)值

本研究中以UPLC技術(shù)建立的絞股藍(lán)藥材指紋圖譜，分離效果較好。對(duì)10批絞股藍(lán)藥材標(biāo)定了9個(gè)共有峰，比較了浙江、陜西、四川和湖南4個(gè)產(chǎn)地絞股藍(lán)的差異，為絞股藍(lán)質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。