麥冬皂苷D′對(duì)心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究*

林蕓蕓，顧申紅△，宋艷玲，蔡海云，譚 琰

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 海口 570000；2.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，海南 海口 570000）

麥冬Ophiopogon japonicus（Linn.f.）Ker-Gawl.有生津解渴、潤(rùn)肺止咳之功效［1］，有明顯的抗心肌缺血功效，化學(xué)成分含麥冬皂苷 A，B，B′，C，C′，D，D′等［2-3］。麥冬皂苷D（OPD）可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞鈣通道穩(wěn)態(tài)，從而抑制氧化應(yīng)激，減少心肌細(xì)胞凋亡［4］；還可通過(guò)抗氧作用抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌自噬性損傷，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)［5］。麥冬皂苷D′（OPD′）與OPD結(jié)構(gòu)十分相似，然而至今對(duì)OPD′的藥物毒理研究很少。本研究中探討了OPD′對(duì)心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器與試藥

細(xì)胞株：大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心 （ATCC CRL-1446）。

儀器：c150型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binde公司）；SW-CJ型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；DMI8型倒置顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）；MDF-C8V1型-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；FC500MCL型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）。

試藥：DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)為10569010）；胰蛋白酶（批號(hào)為 25200056）；EDTA（批號(hào)為 AM9260G）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，批號(hào)為 10099141）；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)為 D2650），均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。麥冬皂苷D′（上海一飛生物科技有限公司，HPLC法測(cè)定，含量≥98%，批號(hào)為41753-55-3）；MTS細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)為G1780）；Annexin V-FITC ／PI凋亡測(cè)定試劑盒（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)為 APOAF-20TST）；JC-1型線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)為 C2006）。

1.2 方法

細(xì)胞株培養(yǎng)：大鼠心肌細(xì)胞H9c2為貼壁細(xì)胞，在含有10%FBS，100 U／mL青霉素和100 g／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2、37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕吹吸1～2次，后用預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶消化、傳代，平均2 d傳代1次。

細(xì)胞存活率檢測(cè)：將H9c2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按3×104個(gè)／孔的細(xì)胞密度均勻接種于96孔板。第2天待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的OPD′，對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去上清液，每孔加MTS 20 μL和不含血清培訓(xùn)基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。用酶標(biāo)儀在 480 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 ＝1-（OPD′組 A490-校零孔A490／對(duì)照組 A490-校零孔A490）×100%。

心肌細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)：根據(jù)Annexin V-FITC／PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將H9c2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)／孔的細(xì)胞密度均勻接種于6孔板。第2天待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的 OPD′，對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，胰酶消化，離心，收集細(xì)胞，用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)／mL。向細(xì)胞懸液中依次加入Annexin V-FITC和PI溶液，混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

心肌細(xì)胞周期檢測(cè)：按“心肌細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)”項(xiàng)下自“將H9c2細(xì)胞”至“收集細(xì)胞”同法操作，70%冷乙醇（無(wú)水乙醇以PBS配制）固定過(guò)夜，PBS洗滌2次后棄上清液，PI染液冰浴30 min，將試管置室溫避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

線粒體膜電位檢測(cè)：按“心肌細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)”項(xiàng)下自“將H9c2細(xì)胞”至“加等量不含藥物的培養(yǎng)液”同法操作。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為595 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性

MTS法檢測(cè)OPD′對(duì)細(xì)胞的毒性見(jiàn)圖1。隨著OPD′處理濃度的增加，H9c2細(xì)胞數(shù)量呈明顯下降趨勢(shì)，其中5 μmol／L及以上濃度的OPD′對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的毒性作用。

圖1 OPD′對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響

2.2 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)OPD′對(duì)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響。與對(duì)照組相比，OPD′5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。詳見(jiàn)表1。

表1 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，% ）

表1 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，% ）

組別 凋亡率（%）t值P值對(duì)照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L 3.9 ±1.1 4.6 ±1.6 5.1 ±1.7 8.9 ±2.1 11.9 ±1.9 0.624 1.026 3.653 6.311 0.283 0.181 0.011 0.002

2.3 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，5 μmol／L組和10 μmol／L 組 G0／G1期所占比例分別為（48.7 ±0.3）%和（61.4 ± 0.5）%，與對(duì)照組的（32.0 ± 0.4）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L組G0／G1期所占比例與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），詳見(jiàn)表 2。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可將心肌細(xì)胞阻滯于G0／G1期，進(jìn)而造成心肌細(xì)胞周期失調(diào)。

表2 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞周期的影響（%）

2.4 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)OPD′對(duì)心肌細(xì)胞H9c2線粒體膜電位的影響，與對(duì)照組相比，OPD′0.1 μmol／L 組和0.5μmol／L 組細(xì)胞線粒體膜電位無(wú)明顯差異（P＞0.05），而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降（P ＜0.01）。詳見(jiàn)表 3。

表3 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

表3 OPD′對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01。

組別對(duì)照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L MMP（FI）1.21 ± 0.37 0.95 ± 0.12 0.73 ± 0.21 0.41 ±0.14*0.09 ±0.03*t值P值1.157 1.954 3.503 5.226 0.156 0.061 0.012 0.003

3 討論

本研究結(jié)果顯示，OPD′濃度超過(guò) 5 μmol／L 時(shí)，H9c2細(xì)胞存活率明顯下降，凋亡率明顯下降，線粒體膜電位下降；且OPD′可阻滯H9c2細(xì)胞由G0／G1期進(jìn)入S期，使心肌細(xì)胞周期失調(diào)。提示OPD′對(duì)大鼠H9c2細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒性，可能是通過(guò)刺激凋亡通路活化而發(fā)揮作用的。線粒體膜電位的降低，是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，是細(xì)胞早期凋亡的重要指標(biāo)［6］。在凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體的膜電位丟失，線粒體的通透性發(fā)生變化，線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的能力降低，無(wú)法維持其正常功能對(duì)細(xì)胞供能，細(xì)胞就會(huì)發(fā)生凋亡［7］。另一方面，熱休克蛋白Hsp90作為心臟保護(hù)蛋白ErbB2的分子伴侶，可通過(guò)與ErbB2結(jié)合發(fā)揮保護(hù)心臟的作用，而ATP的減少會(huì)降低Hsp90對(duì)ErbB2的親和力，其對(duì)心臟的保護(hù)作用也會(huì)下降［8］。可見(jiàn)，OPD′可能通過(guò)影響高能磷酸池對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。

麥冬含多種甾體皂苷，具有抗疲勞、清除自由基、提高細(xì)胞免疫功能及降血糖的作用［9］。麥冬有鎮(zhèn)靜、催眠、抗心肌缺血、抗心律失常、抗腫瘤等作用，尤其對(duì)增進(jìn)老年人健康具有多方面功效［10］。目前，對(duì)麥冬的藥理活性方面的研究主要集中于其粗提物，對(duì)其中單體化合物研究較少。OPD和OPD′作為麥冬的主要成分，結(jié)構(gòu)十分相似，差異僅為糖基側(cè)鏈取代不同，OPD含有巖藻糖取代基而OPD含葡萄糖取代基［11］。對(duì)于OPD的研究相對(duì)較多：OPD可通過(guò)降低阿霉素誘導(dǎo)的活性氧簇（ROS）累積，進(jìn)而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用［4］；OPD可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路減輕大鼠心肌細(xì)胞的凋亡［12］；另外，OPD可通過(guò)降低自噬抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大［5］。OPD對(duì)心肌細(xì)胞的損傷、肥大均有保護(hù)作用，本研究中發(fā)現(xiàn)OPD′卻對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。OPD與OPD′同為參麥注射液成分，參麥注射液可增加機(jī)體耐缺氧能力，減少心肌耗氧量，并有保護(hù)、修復(fù)心肌細(xì)胞的作用［13-15］，而其不良反應(yīng)可能與OPD′的細(xì)胞毒性相關(guān)。

綜上所述，一定濃度的OPD′對(duì)心肌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用，會(huì)干擾細(xì)胞周期，有一定細(xì)胞毒性。通過(guò)與OPD功能的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)優(yōu)化OPD′結(jié)構(gòu)的方式對(duì)藥物進(jìn)行改良，但OPD′的具體作用機(jī)制和其在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化機(jī)制還需要作進(jìn)一步研究。