CDK8的異常表達對人鼻咽癌細胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響及機制*

彭先兵， 戴潤芝

(湖北醫藥學院附屬人民醫院， 湖北 十堰 442000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全部頭頸部腫瘤的78%左右[1]，其發病隱匿、惡性程度較高、容易發生轉移和復發[2]。目前，臨床上治療鼻咽癌的主要手段是采用手術聯合放化療，其中采用鉑類藥物化療是一種較為普遍的治療方案[3-5]，但是有一定比例的晚期鼻咽癌患者鉑類藥物治療效果不理想[6-7]。細胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)基因產物是細胞周期蛋白依賴性激酶家族中的一員，可啟動DNA 合成、提升細胞周期時相變化及調節細胞轉錄，在細胞的增殖和分化中具有關鍵作用，其異常表達能夠加快細胞周期的運轉，其與結直腸癌、胃癌、子宮頸癌以及惡性黑色素瘤等惡性腫瘤的發生發展以及預后具有一定關系[8-9]。目前關于CDK8與鼻咽癌細胞的生物學行為的關系研究較少，本研究觀察CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F 細胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的影響，為鉑類藥物有效治療鼻咽癌提供依據。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

鼻咽癌5-8F細胞株(美國ATCC公司)，CCK8(DojinDo，日本)，RPMI 1640和MTT(美國Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清(德國PAN-Biotech公司)，兔抗人CDK8單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，兔抗人增殖細胞核抗原多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人Bcl-2、Bax、Cyclin D1、MRP1單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 細胞培養

人鼻咽癌5-8F細胞株用含12%胎牛血清的RPMI 1640培養液，37 ℃下在5% CO2培養箱中進行培養。

1.3 分組干預

培養細胞分為未處理組(不給予任何干預)、陰性對照組(不含CDK8表達的慢病毒轉染)和轉染組(含有CDK8過表達的慢病毒)，每組12個培養皿。慢病毒感染靶細胞的操作流程：第1天，以合適的比例接種靶細胞于T25的培養瓶中(對照組和處理組)；第2天，感染前病毒原液從-80 ℃冰箱取出后冰浴融化，用含5 μg/mL Polybrene的新鮮培養基按合適的MOI值稀釋病毒原液，吸除對照組和處理組原有的培養基，含有慢病毒陰性對照稀釋液加到對照組細胞中，將含有CDK8過表達的慢病毒稀釋液加到細胞中(換液時間可根據細胞狀態可適當延長)。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

轉染后的1 d、2 d、3 d、4 d和5 d收集人鼻咽癌5-8F細胞，制備懸液，接種于96孔板，加150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測570 nm波長吸光度，以反映細胞增殖活性。

1.5 化療藥物敏感實驗

收集對數生長期人鼻咽癌5-8F細胞采用胰酶進行消化，以5×103/孔的密度于96孔板中進行接種，每組設為6個復孔。分別添加1、2、4、8、10、20 μmol/L順鉑，培養48 h后于酶標儀490 nm波長處測吸光度值。

1.6 RT-PCR檢測CDK8 mRNA 的轉錄水平

每名受試者均分別取適量的癌組織、癌旁組織樣本，置于凍存管中，于-80 ℃低溫冰箱總保存用于提取RNA；采用RNA提取試劑盒并嚴格按照說明書中操作步驟對樣本中總RNA進行提取；采用紫外分光光度計測定RNA濃度、純度；將總RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR反應，50 uL PCR反應體系： cDNA模板4 uL、10×PCR buffer 5 uL、正向引物2.5 uL、反向引物2.5 uL、dNTP 1 uL、Taq酶0.5 uL，25 Mm MgCl2 3.5 uL、D DH2O 31.5 uL。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，通過記錄器掃描結果，測CDK8 mRNA 的轉錄水平。

CDK8引物: 正義鏈5′-GGGATCTCTATGTCGGCATGTAG.3′: 反義鏈5′-AAATGACGl]flrGGATGCTFAAGC.3′。

1.7 蛋白質印跡法檢測細胞中CDK8、PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白水平

收集人鼻咽癌5-8F細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣30 μg/孔，10%SDS-PAGE，濕法轉膜，50 g/L蛋白粉封閉2 h，分別添加兔抗人CDK8單克隆抗體 (1∶10 000)、GAPDH(1∶8 000)、Cyclin D1 (1∶10 000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶2 000)、MRP1(1∶1 000)、兔抗人PCNA多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育，加辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶2 000)，TBST漂洗， ECL顯色， Bio-Rad凝膠成像系統顯影。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 CDK8異常表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定

鼻咽癌5-8F 細胞中CDK8 mRNA的轉錄水平和CDK8蛋白的表達高于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 CDK8過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定Tab.1 Identification of CDK8 overexpressed nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與轉染組比較，P<0. 05

圖1 鼻咽癌5-8F 細胞CDK8表達(Westernblot)Fig.1 Expression of CDK8 in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

2.2 CDK8蛋白異常表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響

MTT實驗結果表明，轉染組5-8F細胞增殖速度明顯低于未處理組以及陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組與陰性對照組進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CDK8蛋白異常表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響Tab.2 Effect of abnormal expression of CDK8 on proliforation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

2.3 CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F細胞順鉑敏感性的影響

流式細胞術結果表明，轉染組5-8F細胞化療敏感率明顯高于未處理組以及陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組進行比較，差異無有統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4 鼻咽癌5-8F細胞PCNA蛋白表達水平

蛋白質印跡法檢測結果圖顯示，CDK8-siRNA 轉染組PCNA 蛋白表達低于陰性對照組和未處理組(P<0.05)；CDK8-siRNA轉染組Cyclin D1 蛋白低于陰性對照組和未處理組(0.69±0.06)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖2、圖3。

表3 CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F細胞順鉑敏感性和IC50 值的影響Tab.3 Effect of abnormal expression of CDK8 on cisplatin sensitivity of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and IC50 value

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

表4 蛋白質印跡法檢測鼻咽癌5-8F 細胞PCNA 蛋白和Cyclin D1 蛋白表達Tab.4 Expression of PCNA protein and Cyclin D1 protein in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0. 05

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉染組圖2 蛋白質印跡法檢測鼻咽癌5-8F 細胞PCNA 蛋白表達水平Fig.2 PCNA protein expression in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉染組圖3 蛋白質印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Cyclin D1 蛋白表達Fig.3 Cyclin D1 protein expression in nasopharyngeal carcinoma 5-8f cells

2.5 蛋白質印跡法檢測鼻咽癌5-8F細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達

CDK8-siRNA轉染組Bcl-2 蛋白表達比陰性對照組和未處理組低(P<0.01)。同時，Bax 蛋白表達比陰性對照組和未處理組高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5、圖4、圖5。

表5 CDK8過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定Tab.5 The Bcl-2 and Bax protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

(1)與未處理組和陰性對照組比較，P<0.05

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉染組圖4 蛋白質印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Bcl-2蛋白表達Fig.4 The Bcl-2 protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

注：1為未處理組，2為陰性對照組，3為轉染組圖5 蛋白質印跡法分別檢測鼻咽癌5-8F 細胞Bax蛋白表達Fig.5 The Bax protein expression of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma

3 討論

我國鼻咽癌的發病率居世界首位，且鼻咽癌具有較高的死亡率[10-11]。目前，以鉑類為基礎的同步化療效果較差，其中化療耐藥性是治療失敗的關鍵因素[11-12]。因此，研究化療耐藥性的分子標志物對于緩解腫瘤細胞對化療藥物敏感性十分關鍵。CDK8 基因中包含5 個轉錄子，而僅有其中1 個轉錄子能夠編碼出現CDK8 蛋白[13-14]。不一樣的細胞周期蛋白依賴性激酶都包含有一段相似的結構域，并與細胞周期蛋白結合具有密切關系[15]。另外，研究人員在細胞周期蛋白依賴性激酶分子中探索到一些關鍵位點，并針對這些位點進行磷酸化修飾，發現能夠調控細胞周期蛋白依賴性激酶的活性[16-17]。CDK8 屬于調節復合體的一員，在轉錄過程中存在關鍵意義，CDK8能夠對關鍵轉錄因子的穩定性和活性產生直接影響，從而對細胞的轉錄進行控制。CDK8 與細胞周期蛋白C于細胞G1 /S 期協同作用，其在異常表達時導致細胞周期調控點失常，正常細胞逐漸進入到細胞周期，進而引發胰腺癌、胃癌以及膀胱癌的發生發展并發生淋巴結轉移[18]。另外，CDK8 基因能夠和p53、早期生長反應基因和多梳基因蛋白EZH2 協同作用，從而對細胞進行調節，CDK8表達的改變與一些惡性腫瘤的發生發展具有直接關系，其作用機制可能與通用轉錄因子TFIIH 的磷酸化存在一定的關系[19-20]。

本研究選取經典鼻咽癌細胞系5-8F 為研究對象，通過pcDNA3.1/CDK8對鼻咽癌5-8F 細胞進行轉染，通過Realtime-PCR以及Western-blot 對CDK8異常表達進行驗證，并通過MTT以及流式細胞術研究CDK8 異常表達對5-8F 細胞增殖、凋亡的影響。結果表明，CDK8異常表達能夠下調鼻咽癌5-8F 細胞的增殖速度，故推測CDK8可提升鼻咽癌5-8F 細胞對化療藥物的敏感性。本實驗結果表明，CDK8異常表達可以提升順鉑對鼻咽癌5-8F 細胞生長的抑制活性，通過研究結果可以證實CDK8異常表達與順鉑可以協同協同抑癌活性。為了探索CDK8異常表達緩解鼻咽癌5-8F細胞順鉑耐藥的機制，我們研究了CDK8異常表達對鼻咽癌5-8F 細胞相關基因表達的影響，研究發現，腫瘤細胞的代謝、凋亡和其對化療藥物的攝入或者外排功能發生紊亂是引發化療耐藥性的關鍵因素。結果表明，CDK8異常表達能夠下調鼻咽癌5-8F 細胞中Cyclin D1 的表達。研究發現，CDK8異常表達可以上降低Bcl-2 表達，上調非小細胞肺癌細胞細胞的化療敏感性[21]。Bcl-2 是凋亡相關蛋白，Bcl-2過量表達可增強癌細胞的化療耐藥性[22-24]。本研究發現，鼻咽癌5-8F細胞的CDK8異常表達可下調Bcl-2 表達、上調Bax 表達和細胞凋亡率。該結果表明，順鉑能夠可以上調鼻咽癌5-8F 細胞的化療敏感性，其機制與上調Bax 表達、下調Bcl-2、MRP1、PCNA和 Cyclin D1表達有關。。

綜上所述， 鼻咽癌5-8F 細胞中CDK8的異常表達能夠抑制其增殖，上調其化療敏感性，即CDK8異常表達實鼻咽癌實施基因治療的候選靶點。