胰酶稀釋法提取乳鼠原代海馬神經元*

康楊婷， 王麗琨， 伍國鋒***

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學附院 急診神經科， 貴州 貴陽 550004)

海馬區域在學習、記憶、認知等高級神經功能活動中有著至關重要的作用[1-5]，疾病累及海馬組織常可導致癲癇、阿爾茨海默病等相關疾病。文獻報道，海馬神經元的培養多采用多聚賴氨酸提前24 h包被、胰蛋白酶消化、含血清培養和阿糖胞苷處理的方法[6-8]，既往相關實驗方法均有神經元細胞難以存活、雜質細胞多等缺點[9]，本研究采用胰酶稀釋法分離海馬神經元，以含有1% B27的Neubasal培養基進行無血清培養，對比未稀釋胰酶的培養方法，該法獲得了生長良好、純度較高、數量更多的海馬神經元，為神經、精神系統疾病的研究提供了足夠和高質量的細胞模型，報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

出生24 h內SD乳鼠，雌雄不限，體質量為3～6 g，普通(SPF)級，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(美國SCIENCELL 公司)、多聚賴氨酸(美國Sigma 公司)、0.25%胰酶消化液(美國HyClone 公司)、DMEM/ F12(美國 Hyclone 公司)；Neurobasal 培養基(美國 Gibco 公司)、L-Glutamine(美國索萊寶公司)、B27(美國Gibco 公司)、封閉山羊血清(美國索萊寶公司)、神經元特異性烯醇化酶抗體(NSE抗體，上海博奧森公司)、Alexa fluor 488標記的山羊抗兔 IgG(上海博奧森公司)、DAPI染色液(上海博奧森公司)、4%多聚甲醛(美國索萊寶公司)、聚乙二醇辛基苯基醚(美國索萊寶公司)、PBS緩沖液(美國HyClone 公司)、青霉素/鏈霉素(美國HyClone 公司)及D-Hanks液(美國索萊寶公司)。主要儀器有二氧化碳恒溫培養箱、生物安全柜、倒置相差顯微鏡及熒光倒置顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1多聚賴氨酸包被 多聚賴氨酸(×10)與高壓滅菌雙蒸水按1∶9稀釋，用巴氏滴管吸取已稀釋的多聚賴氨酸鋪滿培養板，置入37 ℃培養箱中放置2～4 h后回收多聚賴氨酸，鋪板前用PBS清洗3次備用。

1.3.2溶液配制 種植液：DMEM/F12 42 mL，胎牛血清 7 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/鏈霉素 0.5 mL。飼養液：Neurobasal 培養基 48 mL，B-27 1 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/鏈霉素 0.5 mL。0.125%的胰酶消化液：用0.25%的胰酶消化液，加入等體積PBS緩沖液配制0.125%胰酶消化液。

1.3.3海馬組織提取 參考文獻[10-12]方法提取海馬組織，將實驗乳鼠用75%的酒精浸泡消毒3～5 min，斷頭后暴露左右大腦半球、去除表層腦組織后，分離兩側月牙狀的海馬并置入盛有預冷的D-Hank’s平衡鹽溶液中；20倍放大鏡下剔除海馬的血管及腦膜，再將海馬置于冰上裝有4 mL種植液的離心管中。

1.3.4分組及處理 實驗分為胰酶稀釋組和胰酶未稀釋組，分別用0.125%及0.25%的胰酶提取海馬神經元。胰酶稀釋組：提取的海馬組織靜置2 min后棄掉上清液，用PBS清洗2次，機械吹打20～40次，予1 000 r/min離心 5 min，去掉上清液，加入0.125%胰酶消化，胰酶的量為海馬組織的10倍，機械吹打20次，將制備好的細胞懸液加入培養皿中，放入37 ℃孵育箱消化15 min，消化期間每隔5 min搖晃1次培養皿，使組織充分消化。胰酶未稀釋組: 將海馬組織用PBS清洗2次，去掉上清液，加入0.25%胰酶消化液，其余操作步驟相同。兩組均以胎牛血清終止消化，用200目的篩網過濾后離心棄掉上清液制成細胞懸液，按細胞密度為1×109個/L接種，置入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。先予以種植液培養4～5 h后，更換為飼養液，每3 d半量或1/3量換液，同時觀察獲得的細胞數量。

1.3.5免疫熒光法鑒定海馬神經元及純度 選取第7天的海馬神經元，用多聚甲醛、0.5%Tritonx-10和5% BSA固定、透化、封閉神經元，然后加入1∶200神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗體。次日避光加入1∶200的山羊抗兔IgG標記的二抗，靜置2 h后避光加入DAPI，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞及細胞核。隨機選取5個視野，計數其陽性細胞的個數，并計算陽性神經元的百分率，取平均值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0進行統計學分析，兩組數據進行統計分析前先進行Levene方差齊性檢驗，若方差齊，兩組變量采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察

海馬神經元接種到培養板中，可見細胞呈圓形，有明顯光暈。胰酶稀釋組：接種4～5 h后，約90%以上細胞已經貼壁，鏡下細胞呈圓形，少數細胞已長出細小突起。胰酶未稀釋組：8～10 h細胞70%以上貼壁，有時甚至延長到72 h才能完全貼壁。細胞貼壁后換用無血清飼養液，1 d后大部分神經元長出1個細小突起；培養2～3 d，神經元的突起變長變粗、突起個數增多、細胞突起出現稀疏網狀連接；培養4～6 d，神經元細胞聚集出現緊密的網狀連接，細胞的突起增長增多；培養7～9 d，神經元胞體飽滿，呈圓形或不規則形，突起分支很多，形成致密細胞網絡。在顯微鏡下對兩組細胞進行計數，胰酶未稀釋組細胞個數多于胰酶稀釋組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

(1)與稀釋組比較，P<0.01圖1 胰酶稀釋組與胰酶未稀釋組所獲得的海馬神經元數(200×)Fig.1 The numbers of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group and 0.125% trypsin group

2.2 海馬神經元純度

海馬神經元培養第7天時，細胞已經成熟，因此本實驗選擇在第7天時對稀釋組細胞進行純度鑒定。胞體和樹突呈現綠色為NSE陽性海馬神經元(圖2A)，神經膠質細胞、成纖維細胞均不染色，同時用DAPI對細胞核進行藍染獲得細胞總數(圖2B)。經鑒定，陽性反應海馬神經元的純度為90%以上。

注：A中綠色熒光為表達NSE陽性的海馬神經元，B為經DAPI法藍染的海馬神經細胞核圖2 胰酶稀釋組海馬神經元純度鑒定(免疫熒光，×200)Fig.2 Identification of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group

3 討論

在神經精神疾病的研究中已經廣泛地應用海馬神經元作為細胞模型，尤其是在神經系統疾病如AD、癲癇、腦血管疾病研究中尤其重要。但是神經元的培養仍然存在雜質細胞多、生長狀態差等問題。由于神經元在體外培養存活時間短，而且生長緩慢，如何得到純度高、活力好和體外存活時間長的神經元仍然是一個值得探討的難題。神經元在海馬組織中聚集，為獲得純度高、雜質少的神經元常優先選擇海馬區域作為取材部位。

神經元是高度分化的細胞，一般只作原代貼壁培養，因此神經元接種后的貼壁情況對于它的存活有著關鍵作用。由于神經元不具有良好的貼壁能力，因此需要提前在培養板表面添加可加強細胞貼壁的物質以改變培養板上的電荷，使細胞更易于結合貼附，特別是需要長期培養細胞完成后續研究的實驗[15-16]。大部分文獻中多采用多聚賴氨酸包被培養板[17-18]。在以往的研究中發現大部分以采用胰蛋白酶消化海馬組織[19-20]，但是胰蛋白酶消化的濃度及時間影響神經元提取質量。海馬神經元的分離方法有多種，本實驗采用將胰蛋白酶的濃度稀釋一半后消化海馬，所得海馬神經元比未稀釋組細胞數目多，存活率高，生長狀態良好。本實驗終止消化使用的是4 mL FBS，終止消化后過濾未完全消化的組織碎片。實驗中先用14%胎牛血清的 DMEM/12將細胞制備為細胞懸液，細胞貼壁后4～5 h更換無血清培養基[21]飼養細胞。主要原因：(1)含有血清的培養基在鋪板初期可促進神經元快速貼壁[22]，一般接種4～5 h后神經元細胞已貼壁牢固，而膠質細胞貼壁能力強但貼壁速度緩慢，因此通過貼壁時間差和及時更換無血清培養液可在一定程度上減少雜質細胞，使海馬神經元的純度更高；(2)Neuralbasal培養基是一種專用于神經元生長的特殊培養基，含有抑制膠質細胞生長的成分，因此實驗中未使用阿糖胞苷，可減少對神經元的損傷作用，有利于海馬神經元保存良好的生長狀態；(3)B27中含有谷酰胺、轉鐵蛋白等細胞生長所必需的營養因子[23-24]，尤其是含有多種適宜神經元生長的營養因子；(4)飼養液中Neuralbasal培養基、谷氨酰胺與B27配置使用能夠更好地促進神經元細胞的生長，抑制雜質細胞如膠質細胞的生長，從而提高神經元的純度和活性。

通過對原代海馬神經元的培養，總結出以下經驗： (1)稀釋胰酶法可減少胰酶消化液對神經元的損害，細胞純度更高、生長狀態良好；胰蛋白酶相較木瓜酶、Accutase酶更具有經濟效益；(2)全部操作過程應在冰上進行，冰上操作降低腦組織代謝率，減少細胞的損傷，提高神經元的存活率，盡量剝離海馬組織表面的腦膜及血管，因為腦膜和血管剝離不干凈可減少神經元數量以及增加雜質細胞如膠質細胞及成纖維細胞等；(3)雖然膠質細胞貼壁能力強，但貼壁速度較緩慢，故在細胞接種后4～5 h更換為無血清培養基，以通過差速貼壁來去除膠質細胞，增加神經元的純度；(4)稀釋的胰酶消化液的需要量為海馬組織體積的10倍，而且稀釋胰酶法消化海馬組織更加溫和，一般在15 min左右，不宜過長，每5 min搖晃1次，使組織與胰蛋白酶充分接觸，使組織充分消化；(5)神經元接種密度應控制在1～10×109個/L，細胞密度低，細胞間隙增大，神經元之間缺乏營養支持無法形成網絡正常生長，細胞過密使培養基中營養物質消耗過快，從而導致神經元之間產生接觸抑制。

通過該實驗方法可獲得純度高、狀態良好的原代海馬神經元，而且試劑的配置及操作相對簡單，為以海馬神經元為基礎細胞模型的神經系統相關疾病提供了實驗基礎。