口腔鱗癌中STAT3的表達和腫瘤相關巨噬細胞含量的相關性分析*

葉 丹， 馮紅超， 宋宇峰， 馬竹君

(1．貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550004； 2．貴陽市口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 貴州 貴陽 550001； 3．貴州省食品藥品監(jiān)督管理局， 貴州 貴陽 550004)

口腔鱗狀細胞(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤，其浸潤轉移是引起患者死亡的主要原因[1]，因此針對OSCC的相關治療研究非常重要。課題組前期研究證實腫瘤組織中存在大量巨噬細胞浸潤即腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)，并且能極化為M1 型、M2 型[2]。在腫瘤組織及其微環(huán)境中均存在大量巨噬細胞浸潤, 它們與腫瘤的發(fā)生、生長、轉移有密切的關系[3]。目前大量研究提腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中TAMs的浸潤在其中起重要作用[4]。信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)是STATs家族中參與多種致癌途徑的樞紐中心，持續(xù)活化的STAT3能導致腫瘤的發(fā)生，在腫瘤形成過程中可通過JAK/STATs 通路不斷活化從而導致癌細胞增殖、惡化[5]。有研究顯示TAMs 可能通過誘導 STAT3 信號轉導通路，激活STAT3 促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[6]。因此本研究以STAT3、巨噬細胞為對象，采用免疫組化法檢測二者在OSCC中的表達以及相關臨床病理特征的分析，研究癌癥中巨噬細胞的極化問題，為腫瘤治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2014-2017年貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院和貴陽市口腔醫(yī)院手術切除、術后病理確診為口腔鱗狀細胞癌的患者42例。其中男 31 例、女 11例，平均60歲。所有患者均為初發(fā)腫瘤原發(fā)病損，未接受任何針對腫瘤放療、化療等治療，排除自身免疫性疾病等基礎相關性疾病。其中高分化23例、中低分化19 例、淋巴結轉移27例。另設15例腫瘤外2 cm正常黏膜組織作對照。本次研究均征得患者知情同意且經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

采用非生物素二步免疫組織化學法，標本切片后經二甲苯, 酒精梯度脫蠟水化, 高溫高壓進行抗原修復。一抗鼠抗人STAT3多克隆抗體(購自proteintech公司)，鼠抗人CD68單克隆抗體，鼠抗人 CD163 單克隆抗體4 ℃冰箱過夜，通用型二抗(北京中杉金橋生物技術公司)37 ℃烤箱孵育30 min,濃縮型DAB(北京中杉金橋生物技術公司)顯色,蘇木精復染后脫水、封片。操作步驟參照試劑盒說明書進行。以 PBS 取代一抗做陰性對照，用已知的陽性組織切片做陽性對照。一抗工作濃度STAT3為1∶150、CD68為1∶40、CD163為1∶75。

1.3 結果判定

STAT3判定標準采用陽性細胞比例和著色強度兩項綜合評定陽性結果。以細胞質出現淡黃色顆粒為陽性細胞,每張切片在高倍鏡下(400倍)隨機選取5個高倍視野，按著色強度評分:0分為無著色、1分為淺黃色、2分為黃色、3分為棕黃色。按陽性細胞百分比評分:0分為陰性、 陽性細胞數≤10%記為1分、11%～50%記為2分、51%～75%記為3分、>75%記為4分。上訴兩項評分的乘積作為總積分,>3為陽性、≤3分為陰性。

巨噬細胞數的評定先在低倍鏡下選取5個染色較好的視野，后在高倍鏡下進行觀察并計數陽性細胞個數，取其平均值做巨噬細胞計數。結果由2位專業(yè)人員獨立閱片評估。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 STAT3、CD68+及CD163+在OSCC中的表達及浸潤數量

STAT3陽性表達主要定位在腫瘤細胞胞漿，染色程度呈黃色至棕褐色,而正常組織中基本不表達或僅部分弱表達，見圖1。CD68+、CD163+細胞主要位于巨噬細胞的細胞膜和細胞質內，分別見圖2、3，在癌周間質呈棕黃色、黃色顆粒彌散分布，正常組織中數量較少。在癌組織STAT3表達、CD163+、CD68+細胞浸潤數明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

STAT3 CD68+ CD163+圖1 口腔鱗癌中STAT3陽性表達、CD68+及CD163+浸潤數量(400×)Fig.1 Positive expression of STAT3 in OSCC

組別STAT3CD163+CD68+病例組(n=42)5.19±2.9357.02±21.6244.02±23.81對照組(n=15)0.80±1.8219.40±9.52 10.07±4.10t6.7309.0828.884P<0.001<0.001<0.001

2.2 STAT3、CD68+、CD163+與OSCC各項臨床病理參數之間的關系

見表2及表3。結果顯示，STAT3、CD68+及CD163+與OSCC的臨床分期、腫瘤細胞的分化程度及淋巴結轉移相關。

表2 STAT3的表達與OSCC臨床病理參數的關系Tab.2 The relationship between the expression of STAT3 and clinical-pathologic factors in OSCC

表3 CD163+、CD68+細胞與OSCC臨床病理參數的關系Tab.3 The relationship between CD68+,CD163+cells and clinical-pathologic factors in OSCC

2.3 STAT3、CD68+、CD163+在口腔鱗狀細胞癌中表達的相關性分析

經Pearson相關性分析，口腔鱗癌中STAT3的表達與CD163+細胞呈正相關(r=0.397,P<0.05)，隨鱗癌惡性程度的增高，STAT3與CD163+的表達均明顯增高。CD163+與CD68+計數正相關(r=0.329，P=0.034)。

3 討論

近年越來越多研究方向轉向腫瘤微環(huán)境，認為腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體局部微環(huán)境異常相關。腫瘤微環(huán)境是腫瘤所處的內環(huán)境,腫瘤細胞和腫瘤間質細胞 (包括巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞等) 分布于腫瘤微環(huán)境中,各個細胞又能夠表達分泌各自相關的細胞因子[7]。其中腫瘤相關巨噬細胞 (TAMs) 是炎性細胞中起主要作用的一員[8]。TAMs在腫瘤間質細胞中占有相當大的比例。巨噬細胞能在腫瘤及腫瘤相關間質細胞分泌的趨化因子和細胞因子的作用下被募集到腫瘤周圍，在腫瘤微環(huán)境下受細胞因子的作用下分化為不同型的TAMs。本次結果巨噬細胞在OSCC中數量明顯高于正常組(P<0.05)意味著腫瘤組織中確實存在著TAMs現象的聚集現象，提示腫瘤中存在著炎癥特別是TAMs的浸潤，在OSCC中同樣可能起著重要的作用。

隨著研究的深入普遍認為可以根據巨噬細胞其表型和分泌的細胞因子類型極化為與急性炎癥、T細胞免疫相關的M1型經典活化的巨噬細胞和促進腫瘤生長有關的具有腫瘤免疫抑制作用的M2型選擇性活化巨噬細胞。查閱相關文獻顯示M2型巨噬細胞更多的參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，提高腫瘤細胞生存和遷移能力，促進腫瘤的轉移并導致預后不良[9]。實驗中CD68是區(qū)別于單核細胞和淋巴細胞的分子標記物，用于標記巨噬細胞但并不能區(qū)分亞型。而CD163和CD206只表達在M2型[10-11]巨噬細胞表面，目前較公認的 M2型特異性標記物通常采用CD163[11-12]，因此為了闡述TAMs與腫瘤間的相關關系，本次實驗選擇以CD68蛋白標記巨噬細胞，CD163蛋白標記M2型巨噬細胞。此次實驗結果顯示CD163+細胞在鱗狀細胞癌組織中浸潤數量明顯升高，隨著腫瘤細胞及炎性因子的聚集并開始生長、浸潤時迫使巨噬細胞極性會更傾向于轉變?yōu)镸2型[ 12-13]這與大多數研究一致。同時在本次實驗中得出CD163+的浸潤數量在淋巴結、分期、分化中差異中有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示可能與腫瘤發(fā)展和轉移有一定關系，絕大多數癌癥的致死是由于腫瘤細胞的轉移和遠處播散，進一步增強了腫瘤的惡性生物學行為，也因此表明巨噬細胞的極化與腫瘤分期有關。

STAT3不僅是眾多致癌途徑的中心調節(jié)樞紐，在腫瘤侵襲和轉移中起著重要作用[14]。在近幾年的研究中STAT3被認為是M2型巨噬細胞極化的主要信號傳導分子之一[15]，在TAMs中起著重要作用。異常表達STAT3能上調VEGF[16]、MMPs、HIF-1α等蛋白促進腫瘤增殖[17]，也有研究顯示STAT3缺乏會抑制血管生成[18]，表明STAT3的高表達與血管生成相關。通過新生血管生成和腫瘤基質重塑促成腫瘤生長、存活和傳播。同時有研究顯示M2型巨噬細胞通過釋放VEGF促進腫瘤轉移和復發(fā)[19]。本研究中STAT3表達量確實在腫瘤組中明顯高于正常組織，且STAT3的陽性表達與臨床分期、分化、局部淋巴結轉移有關(P<0.05)，與鱗癌分化程度呈負相關，當腫瘤發(fā)生淋巴結轉移時, 意味著較差的預后, STAT3表達陽性率也呈升高趨勢，這提示STAT3可能在口腔鱗狀細胞癌發(fā)展及轉移中起作用。而本研究利用免疫組化實驗技術證明了鱗癌組織中高表達CD68+、CD163+、STAT3，在實驗中從相關性分析得知STAT3的表達與CD163+細胞計數呈正相關(r=0.397,P<0.05)，推測STAT3的上調可能促進巨噬細胞向M2型分化，進一步推測二者在口腔鱗癌中可能起協(xié)同作用。

綜上所述，在OSCC中CD68+、CD163+、STAT3的浸潤數量及表達明顯上升，提示它們的異常表達可能與腫瘤的發(fā)生、淋巴結轉移有關，因此檢測三者對于口腔癌發(fā)生發(fā)展提供一定參考。