Isogarcinol對(duì)人紅白血病細(xì)胞HEL的抗腫瘤作用及機(jī)制*

陳 麗， 楊 玨， 邱劍飛， 苑春茂， 吳昌學(xué)， 李艷梅**， 郝小江**

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550014； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

白血病是造血系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病之一，化療是治療白血病的主要手段。傳統(tǒng)的化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)人體正常細(xì)胞也產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用，容易導(dǎo)致化療失敗[1-3]。急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia,AML)是一組造血干或祖細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病，其典型特征為白血病克隆細(xì)胞成熟分化障礙而停滯在細(xì)胞發(fā)育階段，且伴隨凋亡抵抗和惡性增殖[4]。長(zhǎng)期以來(lái)，AML細(xì)胞對(duì)化療藥物的凋亡抵抗是導(dǎo)致化療失敗和疾病復(fù)發(fā)的根源[5]。新的藥物和化療方案在一定程度上改善了這種局面，因而急性早幼粒細(xì)胞白血病有望獲得治愈。然而，大多數(shù)急性髓系白血病亞型的治療，在目前仍然困難重重[6]。已報(bào)道AML的發(fā)生與染色體易位、基因突變等多種因素有關(guān)，其致病機(jī)制尚未完全闡明[7]。HEL(human erythroleukemia)細(xì)胞是1982年從紅白血病患者的外周血中分離的紅白血病細(xì)胞，經(jīng)證實(shí)含有JAK2V617F突變。HEL細(xì)胞在受到不同誘導(dǎo)因素的刺激時(shí)，有向紅系、單核巨噬系或巨核系多向分化的潛能，因此具有很重要的研究?jī)r(jià)值[8]。本研究采用不同濃度本課題組前期分離和鑒定的化合物Isogarcinol處理白血病細(xì)胞系HEL細(xì)胞[9]，探討 Isogarcinol對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡和增殖的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Isogarcinol是本課題組前期分離和鑒定的化合物[9]，結(jié)構(gòu)式如圖1。溶解于DMSO(二甲基亞砜)，儲(chǔ)存濃度為20 mmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩PMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，HiFiScript cDNA合成試劑盒和UltraSYBR混合物購(gòu)自cwbiotech(中國(guó)北京)。引物由Invitrogen(中國(guó)上海)制備，PARP、Cleaved PARP、ERK 1/2和p-ERK 1/2等抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

圖1 Isogarcinol的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Isogarcinol

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HEL細(xì)胞來(lái)自加拿大多倫多大學(xué)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)化合物IC50值 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，離心，用10 %胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基重懸，按每孔8 000個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，按濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L加入Isogarcinol化合物，DMSO為空白對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。用顯微鏡采集圖片，離心，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10 μL含10% MTT的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心去除上清液，每孔加入160 μL的DMSO，室溫震蕩15 min，在490 nm光激發(fā)下用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(OD)值。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，離心，用10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基重懸，按每孔8 000個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中。待細(xì)胞穩(wěn)定，加入濃度梯度為15、10、5 μmol/L的Isogarcinol化合物，DMSO為空白對(duì)照。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)12、24、36、48、72 h的細(xì)胞數(shù)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 利用Annexin V/PI雙染法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HEL凋亡的情況。用DMSO作對(duì)照，加入濃度梯度為15、10、5 μmol/L的化合物Isogarcinol處理12、24、48 h，計(jì)數(shù)每106個(gè)細(xì)胞用100 μL 1×binding buffer重懸，每100 μL 1×binding buffer各加入5 μL的Annexin V和PI染液，室溫避光孵育15 min，離心去除染液，用200 μL 1×binding buffer重懸，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEL細(xì)胞以3×108/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入Isogarcinol終濃度為5、10、15 μmol/L，對(duì)照組加入等量的DMSO。24 h后用Trizol試劑提取總RNA，將各孔裂解液吸到EP管中，加入氯仿，用力振搖。室溫下孵育2～3 min，離心后，轉(zhuǎn)移上層無(wú)色液體至新EP管中。加入異丙醇0.5 mL，混勻。20 ℃下孵育10 min，離心棄上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，用槍吹打均勻，離心后加入DEPC水溶解。用 cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8基因，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primers were used in this study

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEL細(xì)胞以3×108/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入Isogarcinol終濃度為5、10、15 μmol/L，對(duì)照組加入等量的DMSO。24 h后離心收集細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷的裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min，于4 ℃ 12 000 r/min，離心12 min。取上清，即得到細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃熱變性10 min。按相等上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，隨后在冰浴條件下進(jìn)行濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)移完成后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗PARP、cleaved PARP、ERK 1/2、p-ERK 1/2、Bax、Bad、p -Stat3、stat3、c-Myc、cleaved caspase-3、Capase-3、cleaved caspase8、Capase-8、Bcl-2、JAK2和β-actin孵育，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫作用2 h，TBST洗膜3次，然后用LI-COR進(jìn)行掃膜。

1.2.7小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 4～5周齡的SCID小鼠購(gòu)自北京華盛康盛科技有限公司，動(dòng)物雌雄各半。隨機(jī)分為生理鹽水組(Blank)、DMSO對(duì)照組、給藥組按小鼠體質(zhì)量5、2.5 mg/kg Isogarcinol，腹腔注射給藥，每?jī)商熳⑸?次，共注射7次，統(tǒng)計(jì)小鼠的存活時(shí)間和體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Isogarcinol對(duì)人紅白血病細(xì)胞系HEL活性及增殖能力影響

如圖2，通過(guò)MTT細(xì)胞活力測(cè)定Isogarcinol對(duì)HEL的活性，結(jié)果顯示，Isogarcinol對(duì)HEL細(xì)胞具有殺傷作用，在Isogarcinol濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到85%，進(jìn)一步計(jì)算得出其IC50值為5.4 μmol/L。同時(shí)通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Isogarcinol對(duì)HEL的細(xì)胞形態(tài)有影響；提示Isogarcinol能抑制HEL的細(xì)胞活性，同時(shí)用Isogarcinol(0～15 μmol/L)處理細(xì)胞12、24、36、48、72 h后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，顯示出Isogarcinol顯著抑制HEL細(xì)胞的增殖。

2.2 Isogarcinol誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞系HEL凋亡

采用流式細(xì)胞儀分析了Isogarcinol處理后HEL細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示，不同濃度Isogarcinol處理后，HEL細(xì)胞中凋亡細(xì)胞群中存在顯著的劑量和時(shí)間依賴性(圖3)。在Isogarcinol>10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。

2.3 Isogarcinol在RNA水平上調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，Isogarcinol處理HEL細(xì)胞后，促凋亡基因Bax的表達(dá)增加，Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)下調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2、c-Myc的表達(dá)下調(diào)(圖4)。

注：A和B示Isogarcinol對(duì)人紅白血病細(xì)胞系HEL細(xì)胞活力和形態(tài)變化的影響，C示Isogarcinol抑制HEL增殖圖2 Isogarcinol對(duì)人紅白血病細(xì)胞系HEL細(xì)胞活性及增殖的影響Fig.2 The effect of Isogarcinol on viability of HEL cells

與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，(1)P<0. 05，(2)P<0.01圖3 Isogarcinol誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞系HEL細(xì)胞凋亡Fig.3 Isogarcinol induced HEL cell apoptosis

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05圖4 Isogarcinol調(diào)控人紅白血病細(xì)胞HEL中相關(guān)凋亡基因的表達(dá)(qRT-PCR)Fig.4 Effect of Isogarcinol on the mRNA expression levels of apoptosis-related genes

2.4 Isogarcinol通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/Stat3以及凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞HEL的凋亡

為了闡明Isogarcinol誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)了Isogarcinol處理后HEL細(xì)胞裂解液中JAK2/Stat3及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較，Isogarcinol各濃度組Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8和cleaved PARP的相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性上調(diào)，而B(niǎo)cl-2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk及c-Myc的相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性下調(diào)(圖5)。提示Isogarcinol能夠下調(diào)JAK2及p-Stat3 蛋白水平的表達(dá)，可能Isogarcinol通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/ Stat3信號(hào)通路進(jìn)而影響下游相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)HEL細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 Isogarcinol通過(guò)調(diào)控JAK2/Stat3途徑中關(guān)鍵蛋白以及凋亡蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Fig.5 The effect of Isogarcinol on the expression levels of part of genes in JAK2/Stat3 pathway and apoptosis-related genes

2.5 Isogarcinol延長(zhǎng)白血病小鼠存活時(shí)間，提高血紅細(xì)胞比容

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Isogarcinol顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間，并且增加了血紅細(xì)胞比(圖6)，表明Isogarcinol能夠在體內(nèi)抑制白血病的發(fā)生及發(fā)展。

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05圖6 Isogarcinol延長(zhǎng)白血病小鼠存活時(shí)間并提高血紅細(xì)胞比容Fig.6 Isogarcinol prolonged the survival of HEL tumor-bearing mice and increased hematocrit

3 討論

目前白血病的治療手段主要有化療、放療、造血干細(xì)胞移植、生物靶向治療、細(xì)胞免疫治療等。然而，目前的治療手段仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，白血病的治療難度依舊很大，由此帶來(lái)的家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)依舊很重。因此，迫切需要尋找新的治療方法和藥物[10-17]。AML 是一種造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。AML 可由髓系細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而來(lái)，也可繼發(fā)于化療、放療或由其他疾病如骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)演變而來(lái)，繼發(fā)性AML 在分子遺傳特性上與原發(fā)性AML 不同且臨床預(yù)后較差[18]。在AML中有很大一部分病例發(fā)生基因突變從而導(dǎo)致了相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，在原發(fā)性AML 中，F(xiàn)LT3、NPM1、DNMT3α等是常見(jiàn)的突變[19]， 而在繼發(fā)于MPNs 的AML中，JAK2、TENT、IDH1/2、ASXL1 等突變常見(jiàn)，JAK2-STAT 信號(hào)通路異常活化在AML 發(fā)生中有重要作用[20]。

JAK是一類非受體酪氨酸激酶，它可以通過(guò)細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與相應(yīng)受體結(jié)合而被激活。JAK家族有包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。JAK與細(xì)胞因子之間不存在個(gè)體對(duì)應(yīng)，這表明JAKs各家族成員可以通過(guò)一種細(xì)胞因子被激活，并且?guī)追N不同的細(xì)胞因子也可以激活同一JAK[21]。STATs是一類可以與脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)合的特殊蛋白家族。STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。JAK被誘導(dǎo)磷酸化后，活化STAT以形成二聚體，使STAT以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[22]。JAK-STAT信號(hào)通路參與多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程，涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，造血以及免疫功能等[23]。近年來(lái)，在血液系統(tǒng)腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT通路在白血病、淋巴瘤及骨髓增殖性腫瘤的發(fā)病中具有重要作用[24]。Seido Oku通過(guò)干擾RNA阻斷JAK2-STAT5通路發(fā)現(xiàn)，存在JAK2V617的MPN細(xì)胞增殖明顯受到抑制，認(rèn)為JAK2V617F可磷酸化下游STAT3通路[25]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Isogarcinol對(duì)HEL細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示：Isogarcinol作用于HEL細(xì)胞后，與DMSO對(duì)照組相比，顯著抑制HEL細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Isogarcinol處理HEL細(xì)胞12、24、48 h后，隨著Isogarcinol濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Isogarcinol組HEL細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，促凋亡基因Bax明顯上調(diào)，而B(niǎo)cl2、caspase3、caspase8、PARP及c-Myc顯著下調(diào)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，Isogarcinol作用于HEL細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)JAK2、p-Stat3、Bcl2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk和c-Myc相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性的下調(diào)。Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8及cleaved PARP的相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性的上調(diào)。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Isogarcinol小鼠組與DMSO對(duì)照組比，顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間，并且增加了血紅細(xì)胞比，表明Isogarcinol能夠在體內(nèi)抑制白血病的發(fā)生及發(fā)展。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Isogarcinol可顯著抑制HEL細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以得出結(jié)論：Isogarcinol可以通過(guò)抑制JAK2/Stat3信號(hào)通路，導(dǎo)致參與細(xì)胞凋亡的基因出現(xiàn)明顯變化，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。