CD133基因3-UTR區(qū)域變異位點與云南漢族人群宮頸癌的相關(guān)性*

周紫云， 姚宇峰， 張新文， 楊龍雨， 陳 珺， 戴書穎， 史 荔， 嚴志凌

(1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院， 云南 昆明 650500； 3.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室， 云南 昆明 650500； 4.昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 婦科， 云南 昆明 650118)

宮頸癌是引起女性死亡的主要惡性腫瘤之一，發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病人數(shù)約占全球的80%，死亡率接近50%[1]。CD133是宮頸癌腫瘤干細胞表面的標記分子[2]，可通過PI3K、FAK及Wnt/β-catenin等多種細胞信號通路調(diào)控細胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡和代謝[3-6]。研究發(fā)現(xiàn),CD133+宮頸癌干細胞顯示出高度的致瘤性、耐藥性及抗細胞凋亡等特征[7]，提示CD133分子可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CD133基因中的多態(tài)性位點與多種人類疾病存在相關(guān)性[8-15]，因此本研究選取CD133基因3-UTR區(qū)域的兩個單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphisms，SNPs)rs2240688和rs3130，研究其在云南漢族人群宮頸癌患者與健康對照人群中的分布差異，分析其與云南漢族人群宮頸癌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

根據(jù)“知情同意”原則，選取2012年10月～2018年1月在昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院收治的428例宮頸癌患者作為病例組，排除術(shù)前接受放、化療等抗腫瘤治療的患者，排除患有其他惡性腫瘤、或是合并心血管疾病患者，排除合并糖尿病、肝炎、腎病等疾病及資料不全患者。選取同期在昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院參加體檢HPV陰性的正常健康女性455例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1樣本基因組DNA提取 采集研究對象空腹靜脈血，提取外周血基因組DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit，貨號51106)，檢測濃度及純度(超微量紫外可見光光度計ND-2000，Thermo Fisher Scientific)后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SNP位點的基因分型CD133基因中rs2240688和rs3130位點基因分型采用Taqman探針熒光定量PCR的方法進行。用于CD133基因rs2240688和rs3130位點的基因分型的試劑盒分別為C_____89927_1_和C_____89925_20，分型使用的Master Mix試劑均購自美國ABI公司(Applied Biosystems)。基因分型PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min(40個循環(huán))，40 ℃最后延伸5 min；以去離子水代替DNA模板作為基因分型的陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件和Microsoft Excell軟件，病例組和對照組間年齡的差異采用Studentt檢驗，兩組選取樣本的群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用在線軟件SHEsis分析CD133基因位點rs2240688及rs3130位點間的連鎖不平衡[8-9]，并根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建兩SNPs位點的單倍型；采用χ2檢驗分析CD133基因rs2240688及rs3130等位基因、基因型及所構(gòu)建的單倍型的分布頻率在宮頸癌病例組和對照組中的差異，P<0.05表明不同組間的數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息及群體代表性

對照組共納入正常健康女性455例，平均(46.98±7.43)歲；病例組共納入428例，平均(46.25±9.59)歲，兩組受試者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.179)。Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，CD133基因rs2240688和rs3130位點各基因型在病例組(P=0.88、0.75)和對照組(P=0.99、0.37)的分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05)，表明本研究所選取的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。

2.2 CD133基因rs2240688及rs3130位點與與宮頸癌的相關(guān)性

病例組和對照組CD133基因rs2240688及rs3130位點的等位基因和基因型分布頻率見表1。結(jié)果顯示，rs2240688位點等位基因和基因型分布頻率在病例組和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019、0.040)，該位點等位基因G在病例組中的分布頻率顯著高于對照組，是云南漢族人群宮頸癌發(fā)生的風險性因素(OR=1.292，95%CI為1.042～1.601)。而rs3130位點的等位基因和基因型分布頻率在宮頸癌病例組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示該位點與云南漢族人群宮頸癌發(fā)生風險無相關(guān)性。

表1 兩組被檢者CD133基因rs22406882和rs3130位點等位基因及基因型頻率分布Tab.1 The distribution frequencies of alleles and genotypes of rs22406882 and rs3130 between case and control groups

2.3 rs22406882及rs3130位點的連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建

結(jié)果顯示，CD133基因rs2240688及rs3130位點完全連鎖(D′=1.00)。構(gòu)建兩位點的單倍型，并分析分布頻率>3%的單倍型在病例組和對照組中分布頻率，結(jié)果顯示，病例組單倍型 rs2240688G-rs3130C的分布頻率顯著高于對照組(P=0.023)，提示單倍型rs2240688G-rs3130C是云南漢族宮頸癌發(fā)生的風險性因素(OR=1.300，95%CI為1.037～1.630)，見表2。

表2 兩組被檢者CD133基因rs22406882及rs3130位點的單倍型頻率分布特征Tab.2 The distribution characteristic of haplotypes constructed by rs22406882 and rs3130 in CD133 gene

3 討論

CD133編碼基因位于人類染色體4p15上，被認為是與癌癥易感性密切相關(guān)的區(qū)域[10-12]，其編碼蛋白CD133被認為是腫瘤干細胞的重要標志分子[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)CD133蛋白的表達與細胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)[3-5,16-17]。基因的3-UTR區(qū)域可能通過與microRNA的相互作用參與基因表達的調(diào)控[18-20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，位于CD133基因3-UTR區(qū)域的SNPs位點與多種人類腫瘤具有相關(guān)性[21-23]。因此，本研究選取了位于CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688和rs3130兩個SNPs位點，研究其與云南漢族人群宮頸癌發(fā)病風險的相關(guān)性。結(jié)果顯示rs2240688位點等位基因和基因型在宮頸癌病例組和對照組的分布頻率比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果與Liu等[21]在肺癌以及Wang等[22]在胃癌中的研究結(jié)果相一致。有研究顯示rs2240688可能位于microRNA-135a/b的結(jié)合位點，而microRNA-135b在宮頸癌細胞的增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用[24]。因此，推測CD133基因rs2240688位點可能是通過影響靶向CD133 mRNA 3-UTR的microRNA-135b對CD133基因表達的調(diào)控，而在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本研究進一步分析了位于CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688和rs3130位點間的連鎖關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩個位點存在強連鎖。而對構(gòu)建的單倍型與宮頸癌的相關(guān)性進行分析發(fā)現(xiàn)，rs2240688G-rs3130C單倍型與宮頸癌患病風險增加具有相關(guān)性。這也與等位基因分析結(jié)果中rs2240688等位基因G可能是宮頸癌的風險因素的結(jié)果相符。

綜上，宮頸癌是僅次于乳腺癌的引起女性死亡的惡性腫瘤，近幾年宮頸癌在中國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[25]，宮頸癌的早期篩查對于降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。因此，尋找特異性的宮頸癌診斷和治療靶標對于宮頸癌的早期診斷治療非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)位于宮頸癌腫瘤干細胞標志分子CD133基因3-UTR區(qū)域的SNP位點rs2240688與云南漢族宮頸癌的發(fā)生具有相關(guān)性，該位點等位基因G是云南漢人群宮頸癌發(fā)生的風險因素，這為尋找宮頸癌診斷治療靶標提供了基礎(chǔ)的研究數(shù)據(jù)，但因樣本量的關(guān)系，本研究的結(jié)果需大樣本研究來進行驗證。