云南漢族人群CCR5基因啟動子多態性與HCV慢性感染的關系*

陳 珺， 劉舒媛， 聶 磊， 朱永玉， 李傳印， 劉楠楠， 周紫云， 史 荔， 張淑瓊**

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民醫院， 云南 昆明 650041)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，屬黃病毒科的單股正鏈RNA病毒。據WHO《2017年全球肝炎報道》顯示，2015年全世界有7 100萬人存在慢性HCV感染，我國感染率為0.7%，感染者高達987.5萬人[1]。HCV感染后，20%的急性感染者可自發清除，其余發展為慢性持續感染，在30年內，慢性持續感染者有20%～30%發展為肝硬化，每年有1%～2%的肝硬化患者發展成肝癌[2-3]。目前，盡管直接抗病毒(direct-acting antiviral agents，DAA)小分子藥物能夠治愈HCV感染，但近年來新發HCV感染病例仍在增加[4]。HCV感染初期及持續的CD4+T和CD8+T細胞反應對于控制HCV感染十分關鍵，與急性HCV感染患者相比，慢性HCV感染者體內T細胞反應的強度顯著降低[5]。HCV屬于高變異病毒，感染后易產生抗原漂變而逃避宿主的免疫識別[6]。已清除病毒的患者體內有針對各種表位的全面的T細胞反應，而HCV慢性感染者體內僅有少量的HCV特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，提示HCV感染的臨床結局與宿主免疫系統的有效應答有關[7-9]。CCR5(C-C chemokine receptoer type5)是趨化因子CC亞家族受體成員，是人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)進入CD4+T細胞的主要輔助受體[10]。CCR5主要表達于NK細胞、T淋巴細胞、吞噬細胞等免疫效應細胞表面，在抗病毒的免疫應答中，參與調節免疫細胞的活化和遷移，CCR5的表達變化可影響病毒的感染進程[11-14]。有研究發現，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV) 慢性感染者的CCR5表達水平下調[15]。CCR5基因從啟動子區的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點會影響CCR5的轉錄和mRNA穩定性，從而影響CCR5的表達，最終影響機體的免疫應答[10]，但目前未見CCR5啟動子多態性位點與HCV慢性感染相關性的研究報道。本文通過檢測CCR5基因啟動子區域6個SNPs位點，分析這6個SNPs位點的基因型頻率、等位基因頻率及所構建單倍型頻率與HCV慢性感染的關系，報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

根據知情同意原則，隨機選取356例在云南省某醫院就診的HCV慢性感染者作為病例組，所有患者均符合中華醫學會肝病學分會和中華醫學會感染病學分會2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[16]診治標準，臨床和實驗學檢查明確患者血清抗-HCV陽性，HCV RNA≥15 000 U/L持續6個月以上，血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和(或)天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)升高、肝臟病理學符合慢性肝炎表現，且患者未經抗病毒、保肝等治療；排除合并慢性HBV等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎、失代償性肝病、原發性膽汁性肝硬化、遺傳代謝性肝病及肝臟血管病等其他肝病患者。隨機選取353例同期正常健康體檢者(血清抗HCV、HCV-RNA陰性，且血清ALT、AST水平正常)作為對照組。所有受試者均為居住于云南地區的彼此無血緣關系漢族個體，其中病例組男200例、女156例，對照組男180例、女173例。

1.2 方法

1.2.1樣本DNA提取 采集受試者空腹靜脈血5 mL、EDTA抗凝，置-80 ℃保存、備用。按照Qiagen血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2CCR5基因啟動子SNPs檢測 使用以下引物對CCR5啟動子區域進行PCR擴增，CCR5 上游引物序列為5′-GACGAGAAAGCTGAGGGTAAGA-3′，下游引物序列為5′-TAACCGTCTGAAACTCATTCCA-3′，PCR擴增產物為1 388 bp。擴增體系包括：模板DNA 10 ng，上下游引物各10 pmol，TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶，dNTPs)，ddH2O 21 μL，反應總體系50 μL。PCR條件為98 ℃預變性10 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火5 s、72 ℃延伸90 s(共30個循環)。PCR產物進行Sanger測序以檢測該區域中的多態性基因座。

1.3 統計學方法

病例組和對照組受試者的年齡、性別比、肝功能指標等各項基本信息比較采用t檢驗，群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。病例組和對照組間各SNPs的基因型、等位基因頻率差異用卡方檢驗(χ2)，使用SHEsis[17]計算各SNPs位點間的連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)，根據LD結果構建單倍型，兩位點間的LD關系用D′表示，D′>0. 8認為位點間強連鎖，病例組和對照組間單倍型的頻率分布差異用χ2檢驗進行比較。采用SNPStats在線軟件對CCR5基因啟動子區域的SNPs位點進行遺傳模式分析[18]，用于分析的遺傳模式包括共顯性遺傳模式(codominant model)、顯性遺傳模式(dominant model)、隱性遺傳模式(recessive model)、超顯性遺傳模式(overdominant model)及加性遺傳模式(log-additivemodel)；并根據赤池信息量準則(akaikein formation criterion，AIC)和貝葉斯信息準則(bayesian information criterions，BIC)的數值來確定每個位點的最優遺傳模式，即AIC和BIC數值最小的遺傳模式。數據統計分析使用SNPstats軟件進行，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 年齡、性別及血清ALT、AST水平

病例組和對照組的年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)；病例組血清ALT、AST水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；且病例組患者血清ALT、AST水平符合HCV慢性感染的診斷標準，見表1。

表1 兩組被檢者年齡、性別及血清ALT及AST水平Tab.1 Basic characteristics of the subjects

2.2 測序發現的CCR5基因啟動子區域9個SNPs位點

測序結果與GenBank(NC_000003.12)序列進行比較發現，在CCR5基因啟動子區域有9個SNPs位點，分別為rs2227010、rs2856758、rs2734648、rs1799987、rs1799988、rs41469351、rs1800023、rs41355345及rs1800024；其中，6個SNPs位點rs2227010、rs2734648、rs1799987、rs1799988、rs1800023及rs1800024在云南省漢族人群中具有多態性。

2.3 等位基因與基因型分析

CCR5基因啟動子具有多態性的rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs180024 (C>T) SNPs位點在病例組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0. 05)。比較兩組6個SNPs位點基因型和等位基因頻率分布的結果顯示，rs2227010的A等位基因頻率分布差異有統計學意義(OR=0.753，95%CI為0.578～0.983，P=0.026)，但經FDR校正后，差異無統計學意義(P>0.05)；其余5個SNPs位點的等位基因頻率與基因型頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 6個SNPs位點間的連鎖不平衡分析

CCR5基因啟動子區域6個SNP位點的連鎖不平衡分析結果顯示，rs2227010(A>G)，rs2734648(T>G)， rs1799987 (G>A)，rs1799988 (T>C)， rs1800023(G>A)，rs180024 (C>T)位點之間存在強連鎖不平衡(D’>0.8)，見表3。

2.5 單倍型分析

構建CCR5基因啟動子區域6個SNPs位點rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、 rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs180024 (C>T)的單倍型，選取單倍型頻率>3%的單倍型進行分析，結果顯示，共有3種單倍型的頻率>3%，單倍型在病例組和對照組的分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0. 05)，見表4。

表2 兩組被檢者CCR5基因啟動子6個SNPs位點等位基因及基因型頻率分布Tab.2 The distribution frequencies of alleles and genotypes of at 6 SNPs locus in case group and control group

表3 CCR5基因啟動子6個SNPs位點的的連鎖不平衡分析Tab.3 Linkage disequilibrium analysis on 6 SNPs in CCR gene promoter

2.6 遺傳模式分析

分別用共顯性遺傳模式、顯性遺傳模式、隱性遺傳模式、超顯性遺傳模式及加性遺傳模式對各SNPs位點與HCV慢性感染的相關性進行分析，結果顯示，SNPs位點rs2227010在病例組與對照組之間比較，最優的遺傳模式為顯性遺傳模式(P=0.034)和加性遺傳模式(P=0.032)，但經FDR校正后，差異無統計學意義(P>0.05)，其余5個SNPs位點rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023(G>A)及rs1800024 (C>T)基因型在病例組和對照組中的分布頻率比較，差異無統計學意義，見表5。

表4 病例組和對照組CCR5基因啟動子區域6個SNPs位點單倍型頻率比較Tab.4 Comparison of haplotype frequency of 6 SNPs in CCR5 gene promoter region between case group and control group

表5 6個SNPs位點在病例組和對照組中的遺傳模式分析Tab.5 Analysis of genetic patterns of 6 SNPs sites in case group and control

續表5

SNPs位點遺傳模式基因型病例組(n,%)對照組(n,%)OR(95% CI)P校正PAICBICrs1800023共顯性G/G101(28.6)103(28.9)10.75>0.05988.31 002.0 A/G183(51.8)176(49.4)0.94(0.67～1.33) A/A69(19.6)77(21.6)1.09(0.72～1.67) 顯性G/G101(28.6)103(28.9)10.92>0.05986.9996.0 A/G-A/A252(71.4)253(71.1)0.98(0.71～1.36) 隱性G/G-A/G284(80.5)279(78.4)10.49>0.05986.4995.5 A/A69(19.6)77(21.6)1.14(0.79～1.64) 超顯性G/G-A/A170(48.2)180(50.6)10.52>0.05986.5995.6 A/G183(51.8)176(49.4)0.91(0.68～1.22) 加性---------1.04(0.84～1.28)0.74>0.05986.8995.9rs1800024共顯性C/C200(56.7)214(60.1)10.42>0.05987.11 001.0 C/T136(38.5)121(34.0)0.83(0.61～1.14) T/T17(4.8)21(5.9)1.15(0.59～2.25) 顯性C/C200(56.7)214(60.1)10.35>0.05986.0995.1 C/T-T/T153(43.3)142(39.9)0.87(0.64～1.17) 隱性C/C-C/T336(95.2)335(94.1)10.52>0.05986.5995.6 T/T17(4.8)21(5.9)1.24(0.64～2.39) 超顯性C/C-T/T217(61.5)235(66.0)10.21>0.05985.3994.4 C/T136(38.5)121(34.0)0.82(0.60～1.12) 加性---------0.94(0.73～1.20)0.60>0.05986.6995.7

注：加性“---”表示多態性位點如為A>G的變異，則加性遺傳模式表示2GG+AG基因型與AA基因型進行比較

3 討論

CCR5基因位于人染色體3p21.31，由1個啟動子、4個外顯子和2個中間分隔的內含子組成。CCR5屬于G-蛋白耦聯受體超家族成員，是β趨化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β的細胞受體，CCR5主要表達于NK細胞、T淋巴細胞、吞噬細胞等免疫效應細胞表面，在抗病毒的免疫應答中，參與調節免疫細胞的活化和遷移[11-14]。CCR5的表達變化可影響病毒的感染進程。Gilliam等[15]研究表明，下調CCR5的表達，可減緩HIV的感染進程，Vilela等[19]研究發現，CCR5表達缺失的小鼠，可加速HSV(herpessimplex virus，HSV)的清除。Javad等[20]研究發現，與對照組相比，HBV慢性感染者的CCR5表達水平下調。CCR5基因從啟動子區到編碼區有很多多態性位點[21]，這些多態性位點可能影響CCR5的轉錄和mRNA穩定性，從而影響CCR5的表達，最終影響機體的免疫應答[10]。CCR5啟動子多態性與許多病毒的感染相關：rs1799987G基因及rs1799988T基因與HBV感染急性期的病毒清除有關[22]；rs1799987A/G基因變體可減少CCR5的轉錄，從而減緩HIV的感染進程[23]，此外，Shien等[24]研究發現，攜帶rs1799987A/A基因突變的個體，CD4+細胞表面的CCR5水平升高，從而加速了HIV的感染進程。Konishi[25]等研究發現，rs1799987G/G基因與HCV慢性感染者的干擾素治療效果相關，CCR5啟動子區域基因多態性位點的存在可以影響CCR5的表達水平，最終影響病毒的感染進程[25-26]。目前，未見CCR5啟動子多態性位點與HCV慢性感染相關性研究報道。CCR5基因有2個啟動子，位于第1內含子上游的弱啟動子(Upstream promoter,PU)，和位于第1內含子包括第2外顯子，及3外顯子的部分的強啟動子(Downstream promoter,PD)[27]。CCR5啟動子區域的多態性位點，可通過以下2種方式影響CCR5的表達:(1)5’UTR的多態性位點影響啟動子區域結合的轉錄因子的種類，數量及轉錄因子結合的穩定性，從而影響CCR5基因的轉錄，進而影響CCR5的表達水平，rs2734468T基因具有更強的核因子(Nuclear factor,NF)結合活性；(2)5’UTR多態性位點的存在，使得5’UTR區域形成不同的莖環結構，從而影響CCR5 mRNA的轉錄后翻譯，影響CCR5的表達水平[10]。本研究的6個SNPs位點均位于強啟動子PD，因而其多態性可能會影響CCR5基因的轉錄，繼而影響CCR5的表達。rs1799987與HBV感染急性階段的清除[21]、HIV-1的感染進程[28]及干擾素治療HCV的療效[24]有關，而本研究結果顯示，rs1799987與HCV的慢性感染無關。rs1799988C可降低兒童患HIV的風險[29]，rs1800023G基因可降低兒童和成人感染HIV的風險[30]，rs1800024T基因與中國南方漢族HIV-1的感染相關[31]，本研究中，對這些位點與云南漢族人群HCV慢性感染的相關性進行了分析，結果顯示這些位點可能與云南漢族人群HCV慢性感染無關。

CCR5強啟動子PD區域的SNPs位點之間存在強連鎖，不同的CCR5轉錄活性影響了CD4+T細胞的凋亡進程，HHC單倍群的個體具有更多的CD4+T細胞，從而減緩HIV的感染進程[32-33]。本研究中，所有個體的rs2856758(A>G)和rs41469351(C>T)沒有多態性，rs2856758位點均為A，rs41469351均為C，而這兩個位點突變對應的單倍群分別為HHG和HHD，因此在云南漢族人群中，未發現HHG及HHD單倍群。本研究構建了CCR5啟動子區域6個SNPs位點的單倍型，分析結果顯示所構建的單倍型均與云南漢族人群HCV慢性感染無關，在云南漢族人群中，分布頻率最高的單倍型為ATGTGC(47.97%)，AGACAT(19.04%)，GGACAC(15.31%)這一結果與中國南方漢族人群中的單倍型結果一致[31]，其中ATGTGC屬于HHC單倍群，AGACAT屬于HHF單倍群，GGACAC屬于HHE單倍群。

由于SNP位點的頻率分布在不同人群中存在差異性，另外，HCV慢性感染的免疫機制與HIV不同，CCR5是HIV-1早期感染人體的主要輔助性受體，而在HCV的感染進程中，CCR5主要通過影響細胞免疫來調解抗病毒應答[34]，因此CCR5與病原體感染的相關性并不相同。對于對研究云南漢族人群CCR5基因啟動子區域多態性與HCV慢性感染的關系存在一定的局限性，需要在以后的研究中擴大樣本量，并增加其他多態位點的檢測，以期發現與云南漢族人群HCV慢性感染相關的SNP位點。