敲低膜聯蛋白A5對人胃癌細胞Galectin-3表達的影響*

趙依納，王小杰，吳雪艷，代雅蕊，張佳璐，李 欣

（承德醫學院基礎醫學院，河北承德 067000）

胃癌是常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率分別為42.6%和45.0%，位居所有腫瘤前列，嚴重威脅著人類健康[1]。膜聯蛋白屬于鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族，膜聯蛋白A5（ANXA5）是膜聯蛋白家族中分布最廣泛、含量最豐富的成員之一。由于ANXA5的促瘤和抑瘤雙重調控作用及與磷脂酰絲氨酸極強的親和力等多種生物學特性，許多學者已將ANXA5作為分子靶點，從多種角度探索了其在腫瘤發生發展與治療方面的作用[2-4]。研究發現，ANXA5可通過調控上皮間質轉化影響胃癌的發生發展[5]，本課題組前期研究亦證實ANXA5具有抑制胃癌細胞增殖的作用，但具體機制尚不明確[6]。半乳糖凝集素3（Galectin-3，Gal-3）是一種多功能β-半乳糖苷結合凝集素，具有抗腫瘤細胞凋亡的作用[7]。研究發現，Gal-3在胃癌組織中顯著高表達，且在胃癌的發生、發展、侵襲、轉移等方面發揮重要作用[8]。本研究擬觀察抑制ANXA5表達后人胃癌細胞Gal-3的表達情況，探討ANXA5抑制胃癌細胞增殖的機制是否與Gal-3相關，旨在為胃癌發生發展的研究提供新的實驗依據，同時為ANXA5作為腫瘤的治療分子靶點提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器 人胃癌HGC-27細胞和MGC-803細胞，購自上海中國科學院細胞庫。DMEM培養基為美國Gibco公司產品；無支原體胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒，北京索萊寶生物科技公司產品；轉染試劑Lipofectamine2000、靶向ANXA5的siRNA及Trizol，美國Invitrogen公司產品；5×Loading Buffer，購自上海貝博公司。ANXA5、Gal-3兔抗人單克隆抗體，均購自美國Epitomics公司；羊抗兔二抗為美國KPL公司產品；TakaRa反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司。

CO2培養箱，德國賀利公司，型號HER Aceu150；PCR儀，美國MJ公司；紫外分光光度計，美國Thermo公司；Tanon 6100化學發光儀，上海天能公司。

1.2 細胞培養及分組 HGC-27細胞和MGC-803細胞均培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞分為干擾組、陰性對照組和空白對照組，其中干擾組細胞轉染靶向ANXA5的siRNA，陰性對照組細胞轉染非特異性siRNA，空白對照組細胞常規條件下培養。

靶向AnnexinA5 siRNA轉染細胞：轉染前1天將細胞按(4～5)×104個/孔種植于6孔板中，使細胞在24h內達到40%～70%的密度。在無血清DMEM培養基中加入30pmol/L的siRNA Oligo，使終體積為250μl，輕柔混勻；在無血清DMEM培養基中加入5μl Lipofectamine2000，使終體積為250μl，輕柔混勻，室溫放置5min；將靶向ANXA5的siRNA Oligo及陰性對照siRNA Oligo分別和Lipofectamine2000轉染試劑混合，室溫放置20min；將混合物均勻加至培養孔中。轉染后6h更換含血清培養基，繼續培養48h。

1.3 Western blotting法檢測ANXA5和Gal-3蛋白的表達 收集各實驗組細胞，每孔加入120μl RIPA細胞裂解液，充分裂解后提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，與樣品處理液混合后煮沸10min。每樣品孔加樣30μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，ANXA5一抗(1：1000)、Gal-3一抗(1：5000)4℃孵育過夜，羊抗兔二抗(1：5000)室溫孵育1.5h，ECL發光法液顯影。應用Quantity One-v 4.6.2軟件分析顯影條帶，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.4 qRT- PCR法檢測ANXA5和Gal-3 mRNA的表達 收集各實驗組細胞，每孔加入1ml Trizol，提取細胞總RNA后反轉為cDNA。以β-actin為內參，檢測各組細胞ANXA5、Gal-3 mRNA的表達水平。β-actin上游引物5‘TGGCA CCCAGCACAATGAA3’，下游引物5‘CTAAGTCATAGT CCGCCTAGAAGCA3’，擴增的基因片段為186bp；ANXA5的上游引物5‘CTGACTTCCCTGGATTTG 3’，下游引物5‘TGAAGGAGAACCACCAAC-3’，擴增的基因片段為121bp；Gal-3的上游引物5‘TAACCCACGCTTCAA TGAGAACAA3’，下游引物5‘ACAAGTGAGCATCA TTCACTGCAAC 3’，擴增的基因片段為179bp。qRT- PCR反應體系20μl：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ 0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O 6μl。反應條件：預變性95℃ 30s，PCR反應95℃ 5s，60℃ 20s，共40個循環。反應結束后Setup MxPro vl 4.10 系統自動給出Ct值，按照2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.5 統計分析 實驗數據以均值±標準差（±s）表示，應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種胃癌細胞ANXA5蛋白和mRNA的表達情況 與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA干擾組HGC-27和MGC-803胃癌細胞ANXA5蛋白和mRNA的表達水平均明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1：

圖1 Western blotting法檢測胃癌細胞ANXA5蛋白的表達

表1 兩種胃癌細胞ANXA5蛋白和mRNA的表達情況（±s ，n=3）

表1 兩種胃癌細胞ANXA5蛋白和mRNA的表達情況（±s ，n=3）

與陰性對照組相比：*P＜0.05；與空白對照組相比：#P＜0.05

細胞系 組別 ANXA5 mRNA ANXA5蛋白HGC-27 siRNA干擾組 0.373±0.073*# 0.038±0.029*#陰性對照組 1.065±0.093 1.209±0.035空白對照組 1.051±0.072 1.279±0.043 MGC-803 siRNA干擾組 0.123±0.087*# 0.064±0.026*#陰性對照組 1.020±0.028 1.095±0.043空白對照組 1.040±0.057 1.027±0.118

2.2 兩種胃癌細胞Gal-3蛋白和mRNA的表達情況HGC-27細胞：與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA干擾組細胞Gal-3蛋白和mRNA的表達均明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。MGC-803細胞：siRNA干擾組、陰性對照組、空白對照組細胞Gal-3蛋白和mRNA的表達比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表2：

圖2 Western blotting法檢測胃癌細胞Gal-3蛋白的表達

表2 兩種胃癌細胞Gal-3蛋白和mRNA的表達情況（±s ，n=3）

表2 兩種胃癌細胞Gal-3蛋白和mRNA的表達情況（±s ，n=3）

與陰性對照組相比：*P＜0.05；與空白對照組相比：#P＜0.05

細胞系 組別 Gal-3 mRNA Gal-3蛋白HGC-27 siRNA干擾組 1.831±0.069*# 0.712±0.040*#陰性對照組 0.246±0.049 0.565±0.045空白對照組 0.264±0.048 0.582±0.049 MGC-803 siRNA干擾組 1.124±0.063 1.19±0.057陰性對照組 1.079±0.058 1.225±0.036空白對照組 1.138±0.060 1.225±0.051

3 討論

膜聯蛋白A5（ANXA5）是膜聯蛋白家族成員之一，由保守的C端和特異的N末端構成，具有膜融合、離子通道、信號轉導等作用。近年來研究證實，ANXA5是一個重要的腫瘤標志物，不僅在多種腫瘤組織中異常表達，還與腫瘤的分化有關。ANXA5在乳腺癌、宮頸癌、結腸癌中顯著高表達[9-11]，在肺癌中則低表達[12]。Liu等[13]采用RNA干擾技術發現，抑制ANXA5在喉癌Hep-2細胞中的表達可促進喉癌Hep-2細胞凋亡，表明ANXA5具有抑制喉癌凋亡的作用；Wehder等[14]通過RNA干擾技術下調ANXA5在口腔癌A431細胞中的表達，細胞的增殖速率顯著下降，說明ANXA5能夠促進口腔癌細胞增殖。而Gong等[15]的研究表明，上調ANXA5可使細胞周期的G1/S期停滯，從而抑制肺癌細胞的增殖。以上結果表明ANXA5的作用具有組織特異性。

半乳糖凝集素家族是一類含β-半乳糖苷殘基的多聚糖且具有很高親和力的內源性凝集素家族，其家族成員半乳糖凝集素3（Gal-3）在正常組織和腫瘤組織中廣泛表達，具有調節細胞生長和抗細胞凋亡的作用。研究證實，Gal-3作為促癌基因在胃癌組織和細胞中均顯著高表達，且與胃癌組織的分化及浸潤等具有相關性，Gal-3高表達的胃癌細胞，增殖和侵襲能力也明顯增強[16]。

課題組前期研究證實，ANXA5具有抑制胃癌細胞增殖的作用，在胃癌中發揮抑癌基因的屬性[6]。因此，為探討ANXA5抑制胃癌細胞增殖是否與Gal-3相關，本研究采用RNA干擾技術抑制胃癌HGC-27細胞ANXA5的表達后，發現Gal-3在mRNA和蛋白水平的表達均顯著上調，說明ANXA5對Gal-3的表達具有調控作用，因此，ANXA5抑制胃癌細胞增殖的機制可能與Gal-3有關。由于Gal-3具有抗細胞凋亡的作用[7]，那么ANXA5是否通過調控Gal-3的抗凋亡作用來實現其抑制胃癌的增殖作用，課題組將會進行下一步的深入研究。本研究同時發現，ANXA5低表達的MGC-803細胞Gal-3的表達并未發生明顯改變，HGC-27是胃癌未分化細胞，而MGC-803細胞是胃癌低分化細胞，因此猜測出現該結果可能與細胞的分化程度有關，但有待進一步的組織學和細胞學實驗進行驗證。