側(cè)腦室注射瘦素對OEP大鼠子宮腔液MMP-7蛋白的調(diào)節(jié)作用*

司麗娜，陳 磊，魏 萌，喬躍兵，程露陽，楊松鶴△

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校）

瘦素（leptin）最初只被認(rèn)為是一種抗肥胖激素[1]，但瘦素是一種具有多種生物學(xué)作用的激素，在能量平衡、攝食、炎癥、血管發(fā)生、造血功能、免疫調(diào)節(jié)及生殖方面發(fā)揮著重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素可通過影響下丘腦-垂體-性腺軸，調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素的分泌，進(jìn)而影響妊娠、胚胎植入、胚胎發(fā)育等生殖過程；此外，瘦素系統(tǒng)的紊亂還與先兆子癇、多囊卵巢綜合征等生殖系統(tǒng)疾病有關(guān)[2]。然而，瘦素在生殖方面的作用還有很多問題處于爭論中，還需要更深入的研究。為深入探討瘦素在雌性哺乳動物生殖功能調(diào)節(jié)中的作用，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合蛋白印跡法，對側(cè)腦室微量注射瘦素后卵巢摘除術(shù)補(bǔ)充雌激素（OEP）大鼠模型子宮腔液差異蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)瘦素對子宮腔液基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）的表達(dá)具有調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 腦立體定位儀，日本Narishige公司；等電聚膠電泳儀，美國GE公司；Power PAC 3000型電泳儀、Minigel電泳槽及電轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad公司。

瘦素，美國Peprotech公司；丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS），美國Sigma公司；IPG緩沖液（immobilized pH gradient, pH 3-10NL）、蛋白提取試劑盒（2D clean-up Kit）、蛋白質(zhì)定量試劑盒（2D Quant Kit），美國Amersham Biosciences公司；固相pH梯度干膠條（IPG strip，pH 5-8，7cm），美國Bio-Rad公司；蛋白酶抑制劑（Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ），德國Calbiochem公司。

1.2 動物模型的建立及分組 健康成年雌性Wistar大鼠16只，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（清潔級，合格證編號806071），均行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后第15天起項(xiàng)部皮下注射17β-雌二醇（0.1mg/kg/d），連續(xù)注射5d，建立OEP大鼠模型。

成模大鼠隨機(jī)分為瘦素注射組及生理鹽水注射組（n=8），分別側(cè)腦室微量注射瘦素、生理鹽水4μl。微量注射6h后，打開腹腔抽取子宮腔液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雙向凝膠電泳 采用2D clean-up試劑盒提取子宮腔液蛋白質(zhì)，2D Quant Kit測定蛋白濃度后，根據(jù)Grg的方法進(jìn)行雙向電泳[3]。第一向等電聚焦采用線性固相膠條（IPG Strip，pH5-8，7cm）；等電聚焦完成后，第二向用SDS-PAGE電泳（12%分離膠，4%堆積膠）進(jìn)行分離。掃描凝膠獲取圖像，使用ImageMasterTM 2D Platinum 5.00軟件進(jìn)行分析。

1.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）鑒定 2D膠切下的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，獲得肽混合物的肽質(zhì)量指紋譜（PMF），并于SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。

1.5 Western blot法驗(yàn)證 大鼠宮腔液蛋白經(jīng)SDS-PAGE（12%分離膠，4%堆積膠）電泳分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移（200mA，60min）至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉30min，兔抗MMP-7一抗（1：1000）4℃孵育過夜，羊抗兔IgG-AP（1：3000）孵育2h，洗膜后BCIP/NBT顯色觀察結(jié)果。圖像掃描后采用Image J分析軟件分析條帶的平均灰度值，確定條帶中的蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳分離大鼠子宮腔液蛋白質(zhì) 通過建立分辨率高、重復(fù)性較好的大鼠子宮腔液蛋白雙向電泳圖譜（本實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)＞5），選擇12%的2-DE膠圖中的差異目的蛋白點(diǎn)。見圖1：

圖1 OEP大鼠子宮腔液蛋白雙向電泳圖譜

2.2 MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)及數(shù)據(jù)庫檢索 將圖1所示差異蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切下，經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定該蛋白為基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）。見附表：

附表 MALDI-TOF-MS鑒定差異蛋白

2.3 Western blot法結(jié)果 側(cè)腦室微量注射瘦素6h后，OEP大鼠子宮腔液MMP-7蛋白的表達(dá)顯著高于生理鹽水對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2：

圖2 OEP大鼠子宮腔液MMP-7蛋白的表達(dá)

3 討論

瘦素（leptin）是肥胖基因（ob）的表達(dá)產(chǎn)物，是脂肪細(xì)胞分泌的一種由167個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)作用，如能量平衡、血管生成、神經(jīng)內(nèi)分泌等[1]。此外，瘦素還與生殖功能有關(guān)，如調(diào)節(jié)卵巢功能、卵母細(xì)胞成熟、胚胎植入與胎盤形成等[4-5]；同時(shí)，生殖功能受損與瘦素及瘦素受體缺陷的相關(guān)性也提示了瘦素與生殖功能的關(guān)系[6]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素不僅通過對下丘腦（如弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核等）、垂體系統(tǒng)影響促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素的分泌，還可直接調(diào)節(jié)生殖器官的功能，如卵巢、子宮[7]。例如，瘦素及其受體在整個(gè)月經(jīng)周期的子宮腺上皮細(xì)胞及腔上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[8-9]；在增生期早期，瘦素受體（LEPR）的表達(dá)逐漸升高，在分泌期早期達(dá)到峰值，提示瘦素可能在受精卵植入中發(fā)揮作用[10]。

為深入分析瘦素對生殖功能的調(diào)節(jié)作用，本研究在建立OEP大鼠模型后給予大鼠側(cè)腦室微量注射瘦素（4 μl），并采用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合蛋白印跡的方法對大鼠子宮腔液蛋白進(jìn)行差異分析和鑒定，以探討瘦素是否通過下丘腦-垂體系統(tǒng)對下游靶器官進(jìn)行調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，通過對差異蛋白的鑒定發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室微量注射瘦素后可正向調(diào)節(jié)OEP大鼠子宮腔液中MMP-7的表達(dá)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）包括一系列能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)組分的酶，可參與月經(jīng)周期、胚胎發(fā)育、組織重塑、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程[11]。MMPs家族中的MMP-7表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和子宮平滑肌細(xì)胞，能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如蛋白聚糖、纖連蛋白、巢蛋白、層粘連蛋白和彈性蛋白等[12]。MMP-7在月經(jīng)周期中的增殖期及月經(jīng)期在子宮腺上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在分泌期早期的子宮內(nèi)膜基底層和功能層中不表達(dá)，因此提示，MMP-7可能與子宮內(nèi)膜的周期性變化有關(guān)[13-14]；而他們的研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-7在子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)明顯升高[13-14]；而子宮內(nèi)膜癌患者血清瘦素水平明顯高于健康對照組[15]。上述研究結(jié)果表明瘦素和MMP-7均與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，二者可能在女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有相互作用，但具體作用機(jī)制不明確。

綜上所述，大鼠側(cè)腦室微量注射瘦素，可在一定時(shí)間內(nèi)正向調(diào)節(jié)大鼠宮腔液MMP-7蛋白的表達(dá)，但具體機(jī)制有待深入探討；另外，本研究結(jié)果可能為探究女性生殖系統(tǒng)疾病時(shí)瘦素、MMP-7的作用機(jī)制，以及二者的相關(guān)作用提供有價(jià)值的啟示。