膜微粒抑制缺氧無血清誘導的骨髓間充質干細胞的凋亡

金培峰，姜盛，翁家侃，2，王磊，丁露，趙凱翔，孫成超

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心胸外科，浙江 溫州 325015；2.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院 心胸外科，浙江 杭州 310000；3.溫州醫科大學 機能中心，浙江 溫州 325035）

研究表明在心肌梗死（myocardial infarction，MI）后移植骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠有效改善心功能[1-2]。由于MI部位的缺血缺氧，在細胞移植后的24 h后BMSCs的凋亡率達到了37.3%，使細胞移植的治療效果受到嚴重影響[1]，雖然通過基因轉染、添加生物因子能提高BMSCs的抗凋亡能力[3]，但存在潛在的致癌、細胞毒性的等缺點。因此尋找一種安全有效的提高BMSCs抗凋亡能力的方法，成為亟需解決的問題。

細胞膜微粒（microparticles，MPs）是細胞在激活或凋亡過程中從細胞膜上釋放的直徑0.1～1.0 μm的膜包裹的小囊泡，包含著原來細胞中所含的多種信號分子、膜脂類、細胞因子、miRNA、DNA、RNA、蛋白質等物質，有廣泛的生物學功能[4]。如血液循環中的血小板MPs、內皮細胞MPs，淋巴細胞MPs等在促進血管新生、內皮祖細胞的分化、抑制靶細胞的凋亡中起著非常重要的作用[5]。本研究利用MI后血液循環中的MPs來預處理BMSCs，提高BMSCs的抗凋亡能力，從而改善BMSCs移植治療MI的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：32只雌性SD大鼠（體質量200～220 g）用來制作MI模型；3只雄性SD大鼠（體質量60～80 g）用來培養BMSCs。實驗動物均由溫州醫科大學動物實驗中心提供，動物使用批準號為SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：IMDM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），AnnexinV/PI凋亡流式試劑盒（美國BD公司），胰酶（美國Sigma公司），厭氧產氣袋（日本三菱公司），AZD5363（上海碧云天公司），Evans blue（美國Sigma公司），Hoechst33258試劑盒（美國BD公司），Tunel檢測試劑盒（美國羅氏公司），PKH26（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MI模型制作：將雌性SD大鼠在水合氯醛麻醉下和小型動物呼吸機輔助通氣下，左進胸結扎左冠狀動脈前降支，制作大鼠MI模型[6]。

1.2.2 MI后血液MPs的提取和定量：在大鼠的MI模型建立后的24 h用水合氯醛對大鼠腹腔進行注射麻醉后進行全身肝素化。常規消毒鋪巾后，打開腹腔后于腹主動脈取血，將采集到的血液在4 ℃的條件下，分別經過不同轉速的梯度離心法去除血細胞、血小板、血漿，從而獲取血液中的MPs，最后將MPs用PBS重懸后分裝，并用于后續的實驗[7]。為明確MI的面積，在大鼠處死后取出心臟，并用Evans blue生物染色劑對心臟進行灌注染色。為明確所獲取的血液中MPs的濃度并用于后續的實驗，將獲得的MPs使用BCA法來測定蛋白濃度，得出其濃度為（2.00±0.23）μg/mL，并將各個樣本的蛋白濃度統一調整至2 μg/mL用于后續的實驗。

1.2.3 BMSCs的培養：體質量60～80 g的大鼠處死后在無菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，以全骨髓貼壁法分離并培養BMSCs[8]，每間隔48 h換一次含10% FBS的IMDM培養基，當細胞密度達到80%～90%融合時，按照1∶2的比例傳代培養，取生長狀態良好的第3代BMSCs用于本實驗研究。

1.2.4 BMSCs對MPs的攝取作用：將獲取的MPs用PKH26進行染色后，添加到生長良好的第3代BMSCs的細胞爬片中共培養8 h，再將細胞爬片固定后，用DAPI對細胞核復染，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞凋亡模型的建立和MPs的預處理：當第3代細胞生長達到70%～80%融合時用PBS沖洗2次，加入無血清的IMDM培養基及缺氧處理（置于密閉缺氧罐中，內置耗氧劑），置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養6 h。其中正常組（Control組）為完全培養基（IMDM+10% FBS）正常培養；BMSCs在進行缺氧無血清處理前不添加MPs的為陽性對照組（Hypoxia/SD組）；將獲取MI后血液來源的MPs（濃度為2 μg/mL）來對BMSCs進行預處理12 h，后再進行缺氧無血清處理6 h作為MPs組，再利用Annexin V-FITC/PI染色進行流式細胞儀檢測。另外為明確不同濃度下的MPs對Hypoxia/SD條件下BMSCs的抗凋亡效果，分別按照正常濃度（2 μg/mL MPs組）、中等濃度（1 μg/mL MPs組）和低濃度（0.5 μg/mL MPs組）對BMSCs進行預處理后再進行Hypoxia/SD條件下的凋亡處理，并再利用Annexin V-FITC/PI染色進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 凋亡細胞的形態學檢測、Tunel和Westernblot檢測：將進行缺氧和無血清處理后的細胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養基，Hoechst33342終濃度為0.1 g/L，室溫避光反應10 min。用相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察，紫外光激發，觀察凋亡細胞并拍片。在凋亡細胞的

Tunel檢測中，將凋亡處理的BMSCs固定后，加50 μL Tunel反應混合液，充分反應后，再用DAB顯色液進行顯色。最后按常規方法進行蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，自來水藍化，系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。收集各組經過凋亡處理的細胞，提取蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，并按20 μg每孔上樣，SDS-PAGE電泳，隨后將分離的蛋白轉膜至PVDF膜上，并經過5%脫脂牛奶室溫封閉，分別經過一抗和二抗的孵育，再次洗膜，ECL發光，膠片顯影、定影，每個樣本重復3次。用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白caspase-3和cleaved-caspase-3的灰度值和內參β-actin的灰度值的比值代表其相對含量。相對灰度值=cleaved-caspase-3/caspase-3，表示cleavedcaspase-3相對含量高低，反應凋亡情況。

1.2.7 細胞凋亡的相關信號通路檢測：為明確MPs抑制缺氧無血清誘導的BMSCs凋亡的機制，在信號通路研究中，在MPs預處理前1 h添加1.5 μL AKT信號通路阻斷劑AZD5363，經過缺氧無血清凋亡處理后收集各組細胞，用Annexin V-FITC/PI染色進行流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料用 ±s表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MI面積確定 左室前壁由于前降支的梗阻染色陰性，其MI面積為（37.63±2.06）%，達到本研究要求。

圖1 藍色未著色區域為梗死區域（Evans Blue染色）

2.2 BMSCs對MPs的攝取結果 在對BMSCs和MPs進行共培養8 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀察可見細胞質內充滿了點狀的紅染的MPs，見圖2。

圖2 BMSCs攝取經PKH26染色的MPs的激光共聚焦顯微鏡觀察結果（×200）

2.3 MPs對低氧無血清誘導BMSCs的凋亡抑制結果 BMSCs在經過缺氧無血清誘導6 h后發生了細胞凋亡，其主要表現為細胞核的固縮、染色質濃集、細胞變小；MPs能夠有效減少低氧無血清誘導BMSCs凋亡細胞的數量，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。與MPs組比，Hypoxia/SD組cleavedcaspase 3表達量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4。

2.4 AZD5363抑制MPs抗凋亡結果 與Hypoxia/SD組比，MPs能有效減少缺氧無血清環境誘導的凋亡，差異有統計學意義（P＜0.01）；與Hypoxia/SD組比，0.5 μg/mL MPs組也有顯著的抗凋亡作用，差異有統計學意義（P＜0.05），MPs的抗干細胞凋亡作用具有濃度依賴性；AZD+2 μg/mL MPs組的凋亡率顯著低于AZD組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

MI后MI部位缺血缺氧的微環境是導致移植的BMSCs凋亡的主要原因，從而使BMSCs移植治療MI的效果受到了很大的限制，因此如何安全而有效地抑制BMSCs在MI部位的凋亡，提高干細胞移植的治療效率，成為急需解決的問題。MPs可以利用所包涵的miRNA、蛋白等物質介導信息傳遞，在組織修復、細胞信號傳導等起著非常重要的作用[4]。MI后由于機體血流動力學和內環境的劇烈改變，機體產生的MPs會被釋放入血，導致外周血液中MPs會大量增加[9]，而且研究表明血液中MPs所包含的miRNA，如miR-133a、miR-21等，在促進血管新生、內皮祖細胞的分化、抑制靶細胞的凋亡中起著非常重要的作用[10]。因此在本研究中，我們利用MI后的血液中的MPs的這一特性來對BMSCs進行處理，發現其能有效抑制缺氧無血清誘導的BMSCs的凋亡，并且其抗凋亡的作用呈現濃度的相關性，在生理狀態濃度下，其抗凋亡效果最佳。

圖3 分別利用相差顯微鏡、Hoechst33342和Tunel染色的方法來觀測各組細胞的形態學變化及凋亡細胞的陽性率

圖4 各組cleaved-caspase-3和caspase-3的表達及相對灰度值比較

圖5 不同濃度MPs抑制低氧無血清誘導的BMSCs的凋亡和AZD抑制MPs作用的流式細胞儀檢測結果及凋亡細胞比例統計

由于MPs可以自體來源，并且在MI后MPs的量能夠顯著地增加，很好地解決免疫排斥和來源問題，相對于已有的基因轉染、添加生物因子來提高BMSCs生物學功能的方法可能存在的致癌、細胞毒性等缺點，MPs在生物安全性方面更加可靠。并且有研究表明MPs對于靶細胞的表觀改變是穩定的[11-12]，因此MPs是能夠成為提高BMSCs抗凋亡能力而改善移植治療效率的理想因子。

Akt可以通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發揮抗凋亡作用，其可以激活IκB激酶（IκKα），導致NF-κB的抑制劑IκB的降解，從而使NF-κB從細胞質中釋放出來進行核轉位，激活其靶基因而促進細胞的存活。而AZD5363作為Akt信號通路的抑制劑，能夠有效抑制Akt的磷酸化，因此能阻斷Akt抗凋亡的信號通路作用。在本研究中AZD+2 μg/mL MPs組的凋亡率顯著低于單純AZD5363預處理后的AZD組，表明MI后血液中的MPs能夠有效抑制AZD5363的拮抗作用，表明MPs抑制BMSCs的凋亡作用可能主要通過激活Akt信號通路來實現的。

本研究表明MI后血液中提取的MPs能有效地抑制干細胞在缺氧無血清環境中的凋亡，為今后提高MI后移植BMSCs的治療效果提供了新的思路。