車前草中大車前苷的含量測定及提取工藝優選

呂 昂，范 新，蘇 倩，俞文英，余陳歡

(1.杭州市第一人民醫院藥學部，浙江 杭州 310006；2.杭州市婦產科醫院藥學部，浙江 杭州 310008；3.浙江省醫學科學院，浙江 杭州 310013)

車前草又名車前、豬耳草、車輪菜、錢串草等，為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥全草。作為臨床常用中藥，車前草具有清熱利尿、滲濕通淋、止咳化痰、涼血、解毒等功效，用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血及癰腫瘡毒等[1-2]。

車前草的化學成分主要包括環烯醚萜、黃酮、苯乙醇苷、多糖等[3-5]。文獻報道車前草中的苯乙醇苷類成分(如大車前苷)具有抑制糖基最終產物形成[6]、抗氧化[6]、抗炎[7]、解痙[8]等作用，與車前草的功效相吻合，同時，大車前苷為車前草的專屬性成分，在車前草中含量較高，為車前草質量控制的指標性成分。本實驗采用HPLC法測定車前草中大車前苷的含量[1]，并對影響提取車前草的因素進行了考察，通過正交試驗優選出最佳提取工藝，為將其研發為中藥新藥提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配備LC-20AT泵、柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、SIL-20AC自動進樣器、LCsolution色譜工作站，日本島津公司)，Dikma微孔濾膜(0.45 μm)、Sartorius BT125s型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，BUCHI R-210旋轉蒸發儀(瑞士步琦有限公司)，DK-S22型恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，Beckman Coulter 64R高速離心機(貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司)。

1.2 試藥

大車前苷標準品(純度>98%，批號：20141202，南京春秋生物工程有限公司)，車前草(批號：150301，浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司)，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(德國Merck公司)，水為純化水，磷酸等其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(16∶84)；檢測波長：330 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μl；理論塔板數以大車前苷峰計不低于3 000，大車前苷與相鄰組分色譜峰分離度大于1.5；該色譜條件下的對照品與樣品色譜圖見圖1。

2.1.2對照品溶液的配制

精密稱取大車前苷對照品12.51 mg，置50 ml棕色容量瓶中，加60%甲醇溶解至刻度，配成濃度為250.2 μg/ml的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備

稱取車前草飲片10 g，置圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇，在恒溫水浴槽中加熱回流提取3次，每次2 h，趁熱過濾，合并提取液，并定容到一定體積，作為供試品溶液。

2.1.4線性關系考察

分別量取適量對照品儲備液，加60%甲醇稀釋成濃度分別為12.51、25.02、50.04、75.06、100.08、125.10 μg/ml的對照品溶液，搖勻，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(X，μg/ml)，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=15 543X+52 895(r=0.999 6)，結果表明，大車前苷在12.51～125.10 μg/ml濃度范圍內，有良好的線性關系。

2.1.5精密度試驗

取濃度為75.06 μg/ml的大車前苷對照品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算得大車前苷平均峰面積的RSD為0.35%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6重復性試驗

取同一批車前草，平行制備6份供試品溶液，進樣，測定峰面積，計算大車前苷含量，平均值為12.26 mg/g，RSD為2.56%，表明該方法的重復性良好。

2.1.7穩定性試驗

取同一批車前草飲片，制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算其峰面積的RSD為0.86%，表明該樣品溶液在24 h內穩定。

2.1.8加樣回收率試驗

精密稱取已知大車前苷含量的樣品6份，按含量的1∶1加入對照品，按照上述供試品溶液的制備方法制備，測定，計算回收率，結果見表1。

表1 大車前苷的加樣回收率試驗結果(n=6)

結果表明，平均回收率為98.57%，RSD為1.45%，表明該方法可靠性良好。

2.1.9樣品的測定及浸膏得率計算

取適量車前草粉末，精密稱定，制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μl，按“2.1.1” 項下色譜條件測定，采用外標一點法計算樣品中大車前苷的含量。同時，精密吸取樣品溶液30 ml于恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，放入烘箱中烘干至恒重，計算浸膏得率。

2.2 提取工藝考察

2.2.1提取次數的確定

稱取車前草飲片10 g，至圓底燒瓶中，加10倍量70%乙醇，在恒溫水浴槽中加熱回流，提取4次，每次2 h，考察提取次數對大車前苷含量的影響，結果見表2。

表2 提取次數對車前草中大車前苷含量的影響

由表2可知，4次提取后，大車前苷基本提取完全，第3次提取得到的大車前苷已經很低，以提取4次得到的所有大車前苷的量作為大車前苷的總含量時，提取2次的大車前苷提取量為：10.95 mg/g，提取率達87.5%。從工業化生產成本考慮，提取2次更為經濟，因此選擇提取2次即可。

2.2.2正交試驗設計和結果

采用L9(34)重復正交試驗設計，以大車前苷轉移率和浸膏得率為評價指標，考察乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時間(C)3種因素對提取率的影響，每種因素按照3個水平設計試驗方案，因素水平詳見表3。

表3 L9(34)因素水平表

按正交表安排試驗，稱取中藥車前草飲片10 g，將稱好的藥材置于圓底燒瓶中，加溶劑，在恒溫水浴槽里加熱回流提取，趁熱過濾提取液，并定容到一定體積，得各樣品溶液，取樣，按照“2.1”項所述試驗方法測定大車前苷轉移率和浸膏得率，并對試驗結果進行分析，結果見表4～5。

表4 正交試驗方案和結果

表5 大車前苷轉移率、浸膏得率方差分析表

F0.05(2,2)=19.00

由上述直觀分析和方差分析結果可知，乙醇濃度、用量和提取時間這3種因素對車前草乙醇提取物的得率以及大車前苷轉移率均有影響，其中乙醇濃度和乙醇用量的影響較為顯著。從節約成本及有效成分轉移率最大化原則考慮，選擇60%乙醇(A2)、10倍量藥材量(B3)、每次提取1 h(C1)為最佳提取條件。

2.2.3最佳工藝驗證

取車前草藥材，用10倍藥材量的60%乙醇提取2次，每次1 h，3次重復實驗結果表明，大車前苷轉移率分別為84.77%、85.21%、86.33%，浸膏得率分別為19.88%、21.71%、20.56%。

3 討論

3.1 HPLC條件的選擇

在液相色譜條件優化實驗中，比較了甲醇-水系統和乙腈-水系統的分離效果，結果發現乙腈-水系統的分離效果更優。由于大車前苷為弱酸性化合物，在水相中加入一定量酸后，大大改善了色譜峰的拖尾。與乙腈-0.5%磷酸水溶液相比，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，色譜峰的對稱性更好，拖尾因子α=1.030。在流動相比例的調整中，乙腈-0.1%甲酸水溶液從17∶83調整到16∶84時，樣品中大車前苷的分離度得到極大改善。

3.2 提取方法的選擇

在預實驗中，以提取液中大車前苷的含量和提取物的得率作為考察指標，考察了冷浸法、熱回流法、超聲提取法的提取效果，結果發現熱回流法所提取的指標性成分含量較高。在提取溶劑的選擇上，由于苯乙醇苷類極性較大，一般選取水、乙醇、甲醇等溶劑提取，考慮到車前草在水中的提取效率較低，而溶劑甲醇的成本高、毒性大，故選擇乙醇作為提取溶劑。