咳喘六味合劑質量標準提高研究

楊帆平，李國文，奚 燕

(1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院藥物臨床試驗機構辦公室，上海 200062；2.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院藥劑科，上海 200082；3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科，上海 200032)

咳喘六味合劑是以中醫藥理論為指導，結合臨床實踐，將麻黃、附子、黃芩、細辛、桃仁和虎耳草配制而成的院內制劑，該藥溫陽抗寒、化痰平喘，主要用于虛寒型或是寒邪較盛的咳喘治療。哮喘屬于中醫“哮病”范疇，長期臨床經驗表明，中醫藥在治療哮喘方面具有優勢，本方較好地體現了祖國醫學“治病求本”的思想[1]。

咳喘六味合劑適用于腎陽虛哮喘患者，臨床療效顯著[2]，但是其質量標準的制訂時間較早，且僅針對麻黃一種藥味進行了定性鑒別，對外觀、pH值等檢查項缺少有效的含量測定方法。本實驗增加了咳喘六味合劑中的黃芩、細辛的薄層色譜(TLC)鑒別方法，新建了麻黃、黃芩的含量測定方法，并進行了方法學驗證，為提高和完善咳喘六味合劑的質量標準提供了可靠依據。

1 儀器和試藥

Sartorius BS110S分析天平(萬分之一級)；Sartorius CP225D分析天平(十萬分之一級)；硅膠G薄層預制板(青島海洋化工廠)；其余試劑均為分析純；對照品：黃芩苷(批號：110715-201318),黃芩素(批號：111595-201607)，漢黃芩素(批號：111514-201605)，細辛脂素(批號：111889-201504)，鹽酸麻黃堿(批號：171241-201508)，鹽酸偽麻黃堿(批號：171237-201509)，黃芩中藥材(批號：120955-201309)，細辛中藥材(批號：121204-201405)，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供?？却逗蟿┕┰嚻?批號：160918)，龍華醫院制劑室。

2 方法與結果

2.1 黃芩的薄層鑒別

2.1.1供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑5 ml置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)30 ml，超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2對照藥材溶液的制備

取黃芩對照藥材0.5 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)30 ml，按“2.1.1”項下方法制成對照藥材溶液。

2.1.3對照品溶液的制備

取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品，加甲醇溶解，制成每1 ml含1 mg的對照品溶液。

2.1.4陰性樣品溶液的制備

取除黃芩藥材外的其他五味藥材按相同處方配比和工藝制備陰性樣品，取5 ml，再按“2.1.1”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.5薄層條件和結果

按照TLC法[3](《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)實驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各2 μl以及對照品溶液1 μl，分別點于同一聚酰胺薄膜板上，以甲苯-乙酸丁酯-甲醇-甲酸 (10∶3∶1∶2)為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果如圖1所示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯3個相同顏色的斑點，且陰性樣品溶液對結果沒有影響。說明本方法可用于鑒別咳喘六味合劑中的黃芩。

圖1 黃芩薄層鑒別圖1.黃芩苷；2.黃芩素；3.漢黃芩素；4.黃芩對照藥材；5.供試品；6.陰性樣品

2.2 細辛的薄層鑒別[4]

2.2.1供試品溶液的制備

取咳喘六味合劑10 ml，加甲醇50 ml，加熱回流30 min，濾過，蒸干，殘渣加水30 ml使溶解，加石油醚(60～90 ℃)振搖提取2次，每次20 ml，合并石油醚液，揮干，殘渣加乙酸乙酯0.5 ml，使溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2對照藥材溶液的制備

取細辛對照藥材0.5 g，加甲醇50 ml，按“2.2.1”項下方法制得對照藥材溶液。

2.2.3對照品溶液的制備

稱取細辛脂素對照品，加甲醇溶解制成每1 ml含1 mg的對照品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液的制備

取除細辛藥材外的其他五味藥材，按相同處方配比和工藝制備陰性樣品，取10 ml，按“2.2.1”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.2.5薄層條件和結果

按照TLC法[3]實驗，吸取上述溶液各15 μl，分別點于同一硅膠G板上，以環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(16∶3∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果如圖2所示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品溶液對結果無影響。說明本方法可用于鑒別咳喘六味合劑中的細辛。

圖2 細辛薄層鑒別圖1.細辛脂素；2.對照藥材；3.陰性樣品；4.供試品

2.3 麻黃的含量測定[5]

2.3.1色譜條件與系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(4∶96)為流動相；檢測波長206 nm；流速1.0 ml/min。理論板數按鹽酸麻黃堿峰計算，應不低于7 000。

2.3.2對照品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿對照品15 mg，精密稱定置于50 ml量瓶中，甲醇使之溶解，定容至刻度，搖勻；另精密稱定鹽酸偽麻黃堿對照品25 mg，以同法制成溶液；分別精密量取上述溶液5、2 ml，置同一25 ml量瓶中，流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(4∶96)，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑2 ml，置分液漏斗中，加水10 ml及濃氨試液1 ml，搖勻，乙醚液振搖提取3次，每次30 ml，合并乙醚液，加5%鹽酸甲醇溶液5 ml，搖勻，40 ℃回收溶劑至干，殘渣加上述流動相溶解，并轉移至25 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4陰性樣品溶液的制備

取按處方去除麻黃制得的陰性樣品2 ml，按“2.3.3”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.3.5專屬性試驗

精密吸取上述對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，進行測定。結果表明，在本實驗選用的色譜條件下，供試品與對照品溶液在相同保留時間出峰，陰性樣品溶液對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的測定無干擾(圖3)。

圖3 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿HPLC圖A.對照品；B.陰性樣品；C.供試品；1.鹽酸麻黃堿;2.鹽酸偽麻黃堿

2.3.6線性關系考察

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品15.05、9.97 mg，置同一50 ml量瓶中，加上述流動相溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述混合溶液2、5、10、25 ml，分別置50 ml量瓶中，加上述流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取制得的溶液及母液各10 μl，注入液相色譜儀，測定。以對照品濃度為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果顯示，鹽酸麻黃堿在12.04～301.00 μg/ml范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=23.519 8X-10.400 8，相關系數r=1.000 0；鹽酸偽麻黃堿在7.98～199.40 μg/ml范圍內呈現出良好的線性關系，回歸方程為Y=23.986 4X-8.284 7，r=1.000 0。

2.3.7穩定性試驗

制備供試品溶液，分別在6個時間點(0、2、4、8、12、24 h)測定峰面積，每次精密吸取10 μl進樣。結果得到鹽酸麻黃堿在6個時間點的峰面積積分值RSD為0.2%，鹽酸偽麻黃堿的RSD為1.3%，說明咳喘六味合劑在24 h內穩定。

2.3.8重復性試驗

制備6份供試品溶液，分別進樣10 μl，測定含量，結果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的平均含量分別為0.84 mg/ml和0.62 mg/ml，RSD分別為0.11%和0.92%，結果表明本方法重復性較好。

分別由兩人各自配制相同濃度的供試品溶液6份，通過不同的儀器和試劑，計算12個含量數據的相對標準差。結果得到鹽酸麻黃堿含量的RSD為0.21%，鹽酸偽麻黃堿含量的RSD為1.1%，表明試驗符合要求。

2.3.9回收率試驗

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品18.32、15.07 mg，置同一50 ml量瓶中，用上述流動相溶解，稀釋至刻度，混勻，備用；精密量取咳喘六味合劑1 ml，共9份，置分液漏斗中，分別加入上述配制好的對照品溶液0.8、1.0、1.2 ml，平行3份，分別加水10 ml及濃氨試液1 ml，搖勻，乙醚液振搖提取3次，每次30 ml，合并乙醚液，加5%鹽酸甲醇溶液5 ml，混勻，40 ℃回收溶劑至干，殘渣加流動相溶解，轉移至25 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得；計算回收率得到，鹽酸麻黃堿平均回收率為101.7%，RSD為1.5%；鹽酸偽麻黃堿平均回收率為101.6%，RSD為2.4%，結果表明本方法準確度高，回收率較好。

2.4 黃芩的含量測定

2.4.1色譜條件與系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)為流動相；檢測波長278 nm；流速1.0 ml/min。理論板數按黃芩苷峰計算，應不低于5 000。

2.4.2對照品溶液的制備

取黃芩苷對照品15 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3供試品溶液的制備

精密量取咳喘六味合劑5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4.4陰性樣品溶液的制備

取按處方去除黃芩制得的陰性樣品5 ml，按“2.4.3”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.4.5專屬性試驗

精密吸取上述對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，進行測定。結果表明，在本實驗選用的色譜條件下，供試品與對照品溶液在相同保留時間出峰，陰性樣品溶液對黃芩苷的測定無影響(圖4)。

圖4 黃芩苷HPLC圖A.對照品；B.陰性樣品；C.供試品；1.黃芩苷

2.4.6線性關系考察

精密稱取黃芩苷對照品13.88 mg，置50 ml量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1、2、3、5、6、10 ml，分別置50 ml量瓶中，用流動相甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)稀釋至刻度，搖勻。以上溶液及母液各精密吸取10 μl，分別注入液相色譜儀，測定。以黃芩苷對照品濃度為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果顯示黃芩苷在5.18～129.50 μg/ml范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=39.015 1X-15.643 9，r=0.999 9。

2.4.7穩定性試驗

制備供試品溶液，分別在7個時間點(0、2、4、8、12、18、24 h)測定峰面積，每次精密吸取10 μl進樣。結果得到7個時間點測定的峰面積積分值RSD為0.4%，表明咳喘六味合劑在24 h內穩定性良好。

2.4.8重復性試驗

制備6份供試品溶液，分別進樣10 μl。通過計算得到，黃芩苷的平均含量為9.0 mg/ml，RSD為1.0%，結果表明本方法的重復性良好。

分別由兩人各自配制相同濃度的供試品溶液6份，通過不同的儀器和試劑，計算12個含量數據的相對標準差。結果得到樣品含量的RSD為1.3%，表明試驗符合要求。

2.4.9回收率試驗

精密量取咳喘六味合劑2.5 ml，共9份，分別置于50 ml量瓶中，以3份為一組，每組分別加入黃芩苷對照品約18、 22.5、27 mg，甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。計算平均回收率為101.0%，RSD為0.3%，結果表明本方法準確度較高。

3 討論

咳喘六味合劑中的附子是一味常用的溫里藥，生藥材使用前需經炮制減毒，其含有的主要成分可為單酯型和雙酯型生物堿。筆者嘗試用HPLC法對其進行定量測定，但陰性樣品干擾較大，不能準確控制其含量，后續將對此開展研究?；⒍輰儆诿褡遽t藥，未被《中國藥典》收載，只收錄于貴州省地方藥材標準?，F有研究已發現其乙醇提取物中含有多元酚、黃酮、有機酸等[6]多種成分，但由于研究時間較短，需要進一步探索其活性部位的活性成分。

展開劑的選擇對TLC中待鑒別成分的分離效果至關重要。對咳喘六味合劑中的桃仁，筆者曾嘗試以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑進行TLC研究，但無論是日光還是熒光下，都未能在與對照藥材色譜相應位置上顯示相同顏色斑點。而在對細辛的鑒別過程中，筆者采取了兩種不同的方法，其中，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑的方法未能成功分離得到滿意的結果。

對于麻黃中主要藥效成分的含量測定，《中國藥典》(2015年版)標明的測定方法中，色譜柱為乙醚鍵合硅膠C18柱，而本實驗選用了常規的C18柱對其進行含量測定，結果發現兩者的分離度均大于2.0，理論塔板數超過10 000，比藥典方法更加簡便易行。

在黃芩苷含量測定的實驗中，對于流動相的選擇，首先參照《中國藥典》(2015年版)中【黃芩】項下的含量測定方法，然后根據系統適用性要求調整流動相比例，當甲醇與0.1%磷酸的比例為47∶53時，色譜峰分離度較好，理論塔板數高。