玉屏風多糖組分對皮膚角質形成細胞的作用研究

黃 瑾，劉景雪，曾 穎

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥學部，上海 200437；2.上海市浦東新區人民醫院藥劑科，上海 201299)

皮炎(dermatitis)是指由各種內、外部感染或非感染性因素導致的皮膚炎癥，其病因和臨床表現復雜多樣，且反復發作，臨床治療較為困難。以最常見的特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)為例，它是一種慢性的、反復發作的炎癥性皮膚病，常伴有劇烈瘙癢，嚴重影響患者的生活質量[1-3]。隨著對AD免疫病理機制研究的不斷深入，治療AD的療法或藥物主要包括：免疫抑制劑環孢素A、霉酚酸酯、白三烯拮抗劑孟魯司特，針對CD11a、CD20、TNF-α或IgE的單克隆抗體，γ-干擾素以及靜脈注射免疫球蛋白等。上述藥物在臨床試用中均已顯示對AD具有一定療效，但由于副作用大或價格昂貴等原因使應用受到限制。

近年來有文獻報道，中醫經典方劑玉屏風散對治療包括AD在內的多種皮炎有確切效果[4-7]。玉屏風散出自我國元代醫學家危亦林的中醫名著《世醫得效方》，由黃芪、白術、防風三味中藥組成，臨床上將玉屏風散作為中藥免疫調節劑加以使用。多糖組分是玉屏風散發揮免疫干預作用的主要有效部位，能夠增強機體非特異性免疫和黏膜免疫功能。但多糖組分是否在玉屏風散治療皮膚疾病中發揮主要作用，對在皮炎形成發展過程中有重要作用的皮膚角質形成細胞是否有免疫調節作用，目前尚未見報道。本研究分離提取了玉屏風的多糖組分，探討其在體外對皮膚角質形成細胞的免疫調節作用，闡明玉屏風多糖組分的活性作用，為其進一步用于皮炎的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與載體

人皮膚角質形成細胞(keratinocytes，KCs)株HaCaT細胞(中科院上海細胞所)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基常規傳代培養。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)。LPS (E.coli ,O111∶B4 )、辣椒素(capsaicin，CAP，Sigma-Aldrich公司)；TNF-α(美國PeproTech公司)；聚角蛋白微絲蛋白(Filaggrin)的Elisa檢測試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司)；IκBα、P65抗體及磷酸化抗體(Cell Signaling Technology，CST)。玉屏風散由黃芪、白術、防風三味中藥按3∶1∶1組成。實驗中將玉屏風組分進行拆方研究，獲取黃芪多糖(APS)、白術多糖(PAM)、防風多糖(SPS)、玉屏風總水煎物(YPF)和玉屏風總多糖(TP)，均由江蘇永健醫藥有限公司提供。

1.3 玉屏風各組分對皮膚角質形成細胞表達炎

癥因子的影響

HaCaT細胞按常規培養并分入6孔板，培養過夜。加入YPF、APS、PAM、SPS及TP，終濃度均為200 μg/ml。處理30 min后，再加入終濃度為10 μg/ml的LPS培養24 h，收集細胞，提取RNA，用Real-time PCR法檢測相關趨化分子和細胞炎癥因子mRNA表達水平，合成的引物序列見表1。

Real-time PCR實驗條件設置如下，50℃：2 min，95℃：10 min；95℃：15 s，60℃：1 min，40個循環。樣品的半定量比較按以下公式計算：

ΔCt=目的基因Ct-GAPDH Ct。

表1 用于Real-time PCR的各引物序列

1.4 玉屏風各組分對Filaggrin表達的影響

HaCaT細胞按常規培養并分入6孔板，加入各中藥組分處理30 min，再加入刺激劑辣椒素(capsaicin，CAP)10 μmol/L培養24 h，收集細胞和培養上清液，提取RNA，分別采用Real-time PCR法檢測Filaggrin的mRNA(引物序列見表1)表達水平，用Elisa法檢測細胞培養上清液中的蛋白表達水平。

1.5 玉屏風各組分對炎癥相關信號通路NF-κB的影響

HaCaT細胞分別與YPF、APS及TP(200 μg/ml)預孵育2 h，用10 ng/ml的TNF-α刺激20 min，收集細胞，裂解蛋白。用Western blot檢測NF-κB通路中IκB的磷酸化及降解，以及P65的磷酸化水平，來表示這些組分對TNF-α誘導的NF-κB通路活化的影響。

1.6 統計學處理

用軟件SPSS 18進行獨立樣本t檢驗統計分析，當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

2 玉屏風各組分的作用結果

2.1 抑制HaCaT細胞中炎癥因子mRNA表達水平

玉屏風散多個組分均對LPS刺激的HaCaT細胞中炎癥細胞因子IL-1β、IL-8和趨化分子MCP-1的表達有抑制作用(圖1)。其中APS、YPF和TP對炎癥細胞因子白介素(IL)-1β抑制率分別為36.2 %、47.7 %和49.3%；TP對IL-8和趨化分子MCP-1的抑制率最高，分別為105.5 %和61.7%，具有顯著的統計學差異(P<0.05)。

圖1 玉屏風各組分對LPS刺激的HaCaT細胞中炎癥因子mRNA表達水平的影響(n=3) A.IL-1β相對表達量；B.IL-8相對表達量；C.MCP-1相對表達量

2.2 對Filaggrin表達的影響

Real-time PCR實驗結果表明(圖2A)，與CAP組比較，YPF、APS、PAM和TP對Filaggrin的mRNA表達均有促進作用，可分別增加84.5%、33.1%、47.9%和67.6%。同時，Elisa實驗結果(圖2B)表明，與CAP組比較，YPF、APS和TP對Filaggrin的蛋白表達均有促進作用(P<0.05)，提示其對皮膚有較好的保護作用，而PAM組未表現出明顯差異。

圖2 玉屏風各組分對KCs株HaCaT細胞中Filaggrin表達的影響(n=3) A.Real-time PCR實驗結果；B.Elisa實驗結果*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05，與CAP組比較

2.3 對NF-κB信號通路的影響

NF-κB信號通路是炎癥和免疫細胞的共同活化通路。在前期工作的基礎上，選擇YPF、APS和TP(200 μg/ml)，檢測其對TNF-α誘導的NF-κB通路的影響。NF-κB常見的形式是由p50和p65蛋白亞基組成異源二聚體，在靜息狀態時與其抑制物IκB結合以無活性的復合物形式存在于細胞漿，當細胞受到外來刺激時，通過一系列信號轉導途徑，激活系列激酶使IκB降解從而釋放NF-κB，使其從細胞漿移位到細胞核，并在胞核內與相應基因上的結合位點發生特異性的結合，調控炎癥細胞因子、趨化因子、黏附分子等相關基因的表達，參與調控機體的免疫反應和炎癥反應。Western blot結果表明(圖3)，YPF、APS和TP 3種組分均具有顯著抑制HaCaT細胞中NF-κB通路活化的作用，其中以TP作用最強。

圖3 玉屏風各組分對TNF-α誘導的HaCaT細胞中NF-κB通路活化的影響

3 討論

AD表現為明顯的濕疹樣變和皮膚干燥，病程遷延難愈，易反復發作，瘙癢難忍，常影響情緒和睡眠，被醫學界視為“濕疹中最難治的一種”。AD是一種雙相型T細胞介導的疾病，而KCs、朗格罕氏細胞(Langerhans cells，LCs)和炎癥性表皮樹突狀細胞(inflammatory dendritic epidermal cells，IDECs)在炎癥因子分泌和抗原遞呈激活T細胞的過程中發揮重要作用。KCs既是皮膚屏障功能的重要執行者，也是免疫應答的積極參與者，其生物學功能以往被大大低估。KCs還是各種趨化因子和細胞因子的重要分泌細胞，進一步研究其免疫功能將有助于對AD發病機制的理解和開發新的治療策略。

AD的藥物研發一直受到廣泛關注。傳統治療方法(使用激素、抗組胺藥、抗炎藥等)可以暫時緩解癥狀，但停藥后往往復發，且病情加重，甚至轉為慢性。外用糖皮質激素由于作用迅速且療效顯著，常用于AD治療。然而這類藥物長期外用可能引起皮膚萎縮、毛細血管擴張、色素沉著、口周皮炎以及繼發感染等不良反應。玉屏風散方中黃芪益氣固表止汗為君；白術補氣健脾為臣；佐以防風走表而散風邪，合黃芪、白術以益氣祛邪。且黃芪得防風，固表而不致留邪；防風得黃芪，祛邪而不傷正，有補中寓疏，散中寓補之意。黃芪中含有多糖、蛋白質、生物堿、氨基酸、黃酮類、微量元素等活性物質，其中多糖成分的免疫活性最為突出[8]。APS從黃芪中提煉得到，是黃芪的主要生物活性成分。早在20世紀90年代，有日本學者研究發現，黃芪多糖具有增強老齡鼠產生抗體的作用[9]。PAM作為白術的一個重要組成成分，具有毒性小、生物利用度高、藥理作用明確等特點[10]，已經用于食品添加劑，并作為臨床藥物用于恢復期腫瘤患者或在化療時輔助應用，目前已經證明其有明顯的增強免疫作用。防風亦具有增強免疫作用，其有效部位為多糖，SPS具有增強免疫活性，能明顯增加體外培養的巨噬細胞釋放IL-1和IL-8，提高NK細胞和脾淋巴細胞的殺傷活性，促進IL-2對NK細胞的激活[11]；還有研究表明SPS呈劑量依賴性地提高小鼠特異性免疫和細胞免疫功能，還能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖。

由KCs分泌的一種被稱為Filaggrin的分子是構成皮膚屏障功能的重要成分[12]。AD患者皮膚Filaggrin表達減少是導致皮膚屏障功能缺陷的重要原因，而皮膚屏障功能缺陷則使環境中的蛋白抗原、微生物和其他刺激原易于通過表皮層，進而刺激局部免疫細胞，觸發Ⅰ型和Ⅳ型變態反應，這是啟動皮膚炎癥的主要環節。為了進一步考察玉屏風各組分對皮膚的保護作用，筆者驗證了其對Filaggrin表達的影響(該蛋白表達上調可能促進真皮屏障功能的恢復)。

筆者對玉屏風散的多糖組分對皮膚角質形成細胞的免疫調節功能進行了研究，發現APS和TP都有明顯的免疫調節作用，以后者的作用更為顯著。TP可以抑制激活的皮膚角質形成細胞分泌炎癥介質，促進Filaggrin的表達，并對炎癥和免疫細胞的活化具有重要作用的NF-κB信號通路有明顯的抑制作用。這些基礎研究為進一步開發利用中藥方劑玉屏風用于AD的治療闡明了作用機制，打下了良好的基礎。