建立以HIF-1α為靶標的高通量篩選防治動脈粥樣硬化先導化合物的細胞模型

錢俞君, 秦春霞, 孫莉莉, 丁華敏, 李鐵軍

(上海市浦東新區浦南醫院藥劑科,上海 200125)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是多種心腦血管疾病共同的病理學基礎，主要發病機制包括血管內皮損傷、慢性炎癥反應、氧化應激、泡沫細胞形成等[1]。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)與缺氧、炎癥、泡沫細胞形成、氧化應激等眾多AS致病因素密切關聯，提示HIF-1可能是AS發生發展的重要靶標和開發防治AS的藥物新靶點。本研究將建立一個以熒光素酶活性檢測反映HIF-1α活性變化為觀測指標，高通量篩選抗AS先導化合物的體外細胞模型，并通過陽性藥洛伐他汀及姜黃素的抗HIF-1α活性檢測分析對該模型進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設備

人單核巨噬細胞系U937和THP-1系購自上海中科院細胞所；RPMI-1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Lipofectamine2000轉染試劑和Trizol等(Invitrogen公司)；pGL3-Enhancer熒光素酶表達載體、雙熒光素酶活性檢測系統購自美國Promega公司；無內毒素質粒DNA制備試劑盒購自Qiagen公司；蛋白一抗及二抗(Abcam公司)，細胞培養箱(美國Nuaire公司)，定量PCR儀及配套檢測試劑盒(Takara公司)；DNA合成及測序在上海Invitrogen公司完成，洛伐他汀和姜黃素購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1載體構建

文獻查閱HRE核心序列信息為5′-(A/G)CGT (G/C) C-3′，根據核心序列，設計長鏈互補雙鏈引物，為核心序列的7組重復序列，引物兩端添加KpnI和XhoI酶切位點及保護堿基。上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGC ACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCACGTGCCGG-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCACGTGCACGTGCACGT GCACGTGCACGTGCACGTGCACGTCC-3′。引物設計完成之后，按照Page級進行合成。后將雙鏈DNA稀釋退火形成雙鏈DNA，克隆至線性化的表達載體pGL3-Enhancer，構建熒光素酶重組表達載體pGL3-HIF-1α。重組載體經過序列分析確認無誤后，擴增轉化菌株，使用Qiagen的無內毒素質粒DNA抽提試劑盒制備無內毒素質粒DNA。

1.2.2細胞轉染及工具細胞株篩選

取對數生長期U937和THP-1細胞，使用完全培養基(RPMI-1640+10%FBS)調整細胞濃度為1×105個/ml，將細胞接種到6孔板，每孔添加2 ml細胞懸液，37 ℃和5%CO2濃度下培養24 h，按照轉染試劑Lipofectmaine 2000說明書進行pcDNA-GFP質粒轉染實驗。轉染后72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察兩組細胞轉染效率。

1.2.3穩定表達細胞株篩選

以轉染效率高的THP-1細胞進行穩定表達細胞株篩選試驗。將THP-1細胞(1×105個/ml)接種到6孔板培養24 h后，進行pGL3-HIF-1α-HRE質粒轉染。轉染后48 h，使用臺酚藍進行活細胞染色，制備細胞懸液(10個/ml)后接種細胞至96孔細胞培養板，正常條件(37 ℃和5%CO2)繼續培養，每3 d換液，培養至第9天。倒置顯微鏡下觀察，選擇細胞形態均一的6個細胞克隆(標記為C1～C6)后轉移至24孔板繼續培養，再放大培養至12孔板，直至6孔板和10 cm培養皿。然后通過基因篩查的方法對其中的克隆片段HIF-1α-HRE進行定量，根據檢測結果選取其中1株克隆進行后續實驗。

1.2.4RealTime-PCR檢測細胞克隆中HRE相對含量

取對數生長期的6組克隆細胞各1×106個，按照Trizol說明書，提取細胞總RNA，使用通用反轉錄引物Random9并參照試劑盒說明進行反轉錄制備cDNA，然后進行定量PCR反應。檢測引物序列：β-actin上游引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′,β-actin下游引物：5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′; HRE上游引物：5′-GGGGTACCACGTGCACGTGCA-3′, HRE下游引物：5′-CCGGCACGTGCACGTGCACGTGCA-3′，β-actin為內參使用。PCR的反應總體系為20 μl：SYBR Premix Ex Tap 10 μl，上下游引物(20 μmol/L)各0.2 μl，cDNA 2 μl。PCR反應條件：95 ℃，10 min；60 ℃，20 min；72 ℃，20 min，反應設置為40個循環。通過擴增曲線與閾值線的交點來計算每組樣本的Ct值，目的基因相對于內參基因的表達量為2ΔΔCt。根據定量結果，選取HRE表達最高的一株細胞克隆，命名為THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase進行后續實驗。

1.2.5熒光素酶報告基因實驗

取對數生長期THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞，使用完全培養基制備細胞懸液，接種細胞到96孔細胞培養板，正常條件培養24 h，使用完全培養基進行全量換液，同時添加洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黃素(1、2和10 μmol/L)，正常條件培養2 h后，細胞轉入低氧條件(95% N2和5% CO2)繼續培養24 h。而后收集細胞，分別檢測各組細胞熒光素酶活性和HIF-1α蛋白表達。

1.2.6免疫印跡法檢測HIF-1α蛋白表達

離心法收集待測細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。每組樣本取11 μl進行10% SDS-PAGE垂直電泳，濕法將膠中蛋白水平轉移至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入TBST稀釋后的一抗(HIF-1α一抗，1∶500，β-actin一抗，1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；取出后TBST洗膜3次再加入二抗(羊抗鼠二抗，1∶3 000稀釋)，孵育2 h，再洗膜3次，添加化學發光反應底物，進行X光曝片，目的條帶經掃描后通過光密度分析軟件進行分析，Twist蛋白相對含量=目的條帶的光密度值/β-actin條帶的光密度值。

1.2.7統計學處理

2 結果

2.1 pGL3-HIF-1α-HRE表達載體構建

載體經序列分析(圖1)，插入HRE序列與設計序列完全一致。

2.2 工具細胞株篩選

質粒轉染后72 h，筆者發現THP-1細胞的轉染效率(GFP表達細胞占所有細胞的比例)遠遠大于U937(圖2)。細胞的轉染效率是穩定表達細胞株篩選和建立的前提。同時，THP-1細胞增殖旺盛，細胞大小形態更為均一，因此，選擇THP-1進行后續穩定表達細胞株的篩選，即工具細胞株建立。

圖2 U937和THP-1細胞轉染后72 h細胞轉染效率檢測A、C.為可見光下拍照；B、D.為相同視野下的可見光視野

2.3 細胞克隆鑒定

通過熒光定量的方法對形態學初步篩選的6組克隆細胞(C1～C6)中外源基因HIF-1α-HRE序列做了定量分析以選擇高質量細胞進行克隆。結果(圖3)表明，6組克隆細胞中均有外源基因HIF-1α-HRE檢出，其中C1克隆的外源基因相對含量最低，C2最高。與C1比較，C2、C4和C5組克隆HIF-1α-HRE相對含量均明顯升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)。因此，選擇C2號克隆(命名為THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase)進行后續實驗。

圖3 HIF-1α-HRE的定量檢測*P<0.05，**P<0.01， 與C1組比較A.HIF-1α-HRE相對含量的組間差異分析；B.Realtime-PCR檢測原始曲線

2.4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞的熒光素酶活性檢測

THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase經24 h低氧培養，與溶媒對照組比較，胞內熒光素酶活性明顯增強(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)預處理2 h，可以有效抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞熒光素酶升高，與低氧組比較差異有統計學意義(P<0.01)。姜黃素(1、2和10 μmol/L)預處理也可有效抑制低氧引起的熒光素酶升高，其中2 μmol/L和10 μmol/L預處理組與低氧組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞熒光素酶活性檢測*P<0.05，**P<0.01，與低氧組比較

2.5 THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞的HIF-1α蛋白表達檢測

低氧培養24 h能夠明顯增強THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞內HIF-1α表達，與溶媒組比較差異有統計學意義(P<0.01)。洛伐他汀(10 μmol/L)和姜黃素(1、2和10 μmol/L)均可抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞內HIF-1α表達增強，與低氧組比較差異有統計學意義(P<0.01 )。結果與熒光素酶活性的結果相一致(圖5)。

圖5 免疫印跡檢測THP-1-HIF-1α-HRE-Luciferase細胞HIF-1α蛋白表達*P<0.05，**P<0.01，與低氧組比較

3 討論

AS是一個由動脈血管壁粥樣斑塊進行性積聚，最終導致局灶性動脈阻塞的病理過程。天然物質中尤其是中藥中有許多成分如黃酮類，通過抗氧化作用抑制泡沫細胞形成和AS的發生[2]。從中藥及其提取物、單體成分中篩選抑制泡沫細胞形成的活性成分可能是一條可行的便捷途徑，因此建立高通量和特異的篩選模型是十分重要的課題。報告基因法篩藥模型就是針對靶基因表達調控發展起來的功能性新藥高通量篩選方法，即將靶基因表達的調控序列與編碼某些酶活性(如熒光素酶)的基因相連，轉入細胞內，通過簡單地檢測酶活性(如熒光強度)變化，來反映化合物對轉錄因子和靶基因表達的作用性質和強度。

HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α蛋白是HIF-1DNA結合活性的主要決定因素，通過與HRE結合調控相應基因的表達。HIF-1在缺氧適應和許多病理過程中(如腫瘤、心肌缺血、肺動脈高壓和慢性阻塞性肺疾病等)起重要作用[3]。研究表明缺氧在AS發生、發展中起重要作用，而HIF-1是缺氧誘導基因表達的中心調節子[4-5]。AS是一個慢性炎癥過程[1]，包括細胞因子、黏附分子產生、氧化應激、泡沫細胞形成等，而HIF-1是炎癥細胞功能的關鍵調節因子[6]。有報道高膽固醇低密度脂蛋白通過誘導HIF-1α高表達促進內皮細胞VEGF和VEGF受體-2過度表達[7]；而維生素C和維生素E等抗氧化劑通過降低HIF-1α表達從而抑制VEGF和VEGF受體-2上調，是其抗AS的機制之一[8-9]。Shatrov 等[10]報道氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通過氧化還原調節途徑引起人巨噬細胞HIF-1α蛋白積累。本課題組應用體外ox-LDL誘導人單核細胞株U937形成泡沫細胞模型，發現RNA干擾HIF-1α可顯著抑制泡沫細胞形成，抑制許多AS相關基因表達[11]。綜上可見，HIF-1α是泡沫細胞和AS形成的重要靶標，針對HIF-1靶點可研發防治AS的藥物。有報道從天然植物提取物中針對腫瘤細胞HIF-1α為靶點采用報告基因法篩選了HIF-1抑制物[12]。但未見針對單核細胞中HIF-1α為靶點的中藥活性成分篩選的報道。

羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑他汀類藥物是臨床上療效確切的調血脂藥和抗AS藥，目前研究表明他汀類藥物在不降低高脂血癥血漿脂蛋白情況下，可下調人血管內皮細胞和平滑肌細胞HIF-1表達，減輕冠狀動脈壁缺氧和滋養血管生成[13-14]。芹菜素和姜黃素等天然化合物通過降解HIF-1α抑制VEGF表達從而抑制血管生成[15]。本研究中采用洛伐他汀和姜黃素作為陽性對照藥物，觀察對模型體系中HIF-1α表達的抑制作用。

在本研究中，筆者首先構建含人HIF-1啟動子即HRE特定部位和LUC的嵌合體報告基因質粒(pGL3-HIF-HRE-Luc)，進而轉染巨噬細胞THP-1，通過單細胞培養法建立穩定表達細胞株THP-1- HIF-1α-HRE-Luc，即高效HIF-1α活性篩選模型。然后通過研究HIF-1α抑制物工具藥洛伐他汀和姜黃素對篩選模型進行功能鑒定。課題組針對泡沫細胞HIF-1α采用報告基因法建立了高通量細胞篩藥模型，該模型為研發防治AS的新藥提供了有利工具。