毛蕊花苷對高原缺氧小鼠記憶損傷的改善及機制研究

朱玉婷，王謹慧，李茂星, ，李曉琳,，陶文迪，劉延彤

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州總醫院全軍高原環境損傷防治重點實驗室，甘肅 蘭州730050；3.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 7350000；4.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

隨著越來越多的人進入高原地區生活、工作，高原上的低壓缺氧環境作為一種損傷和致病因素逐漸凸顯出來。缺氧可激發機體產生應激反應，引起高山病、肺水腫、腦水腫、感覺及運動功能障礙等一系列急慢性疾病[1-2]，導致記憶損傷，作業效能下降。

毛蕊花苷(圖1)是一種廣泛分布于蓯蓉、馬先蒿、螃蟹甲等多種雙子葉植物的苯乙醇苷類化合物，又稱類葉升麻苷、麥角甾苷。研究發現，毛蕊花苷具有顯著的抗氧化[3]、抗菌抗炎[4-5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、增強記憶力[8]等生理活性。課題組前期研究表明，從藏藥馬先蒿中提取得到的苯乙醇苷富含毛蕊花苷，具有明顯的高原缺氧記憶損傷保護作用[9]。本實驗采用毛蕊花苷干預高原缺氧時小鼠八臂迷宮實驗，從氧化應激方面探究其對高原記憶的改善作用，闡明其可能的機制。

圖1 毛蕊花苷結構式

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性BALB/C小鼠90只，體重(20±2)g，蘭州總醫院動物實驗科提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2012-0020，使用許可證號：SYXK(軍)2012-0029。飼養室溫度為(25±2)℃，每12 h明暗交替，維持飼料喂養，自由進水。為了保證小鼠能健康生長并順利實驗，進行八臂迷宮訓練過程中限制其飲食，使體重維持在自由進食的80%～85%。

1.2 藥品與試劑

毛蕊花苷為實驗室自制(HPLC法測定含量，以毛蕊花糖苷計為81.39%)；總蛋白定量試劑盒(BCA法，批號：20170726)、活性氧(ROS)測試盒(批號：20170724)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒(批號：20170724)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(批號：20170724)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20170726)，均由南京建成生物工程研究所生產。

1.3 實驗器材

RM-200八臂迷宮分析測試系統(成都泰盟科技有限公司)；DYC-3070 大型低壓氧倉(貴州風雷航空軍械有限公司)；BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)；全自動樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24(上海凈信科技)；Sigma 3K15低溫離心機(德國Sigma公司)。

2 方法

2.1 八臂迷宮訓練

八臂迷宮實驗開始前先讓小鼠在迷宮內適應環境，2次/d，一次3～4只。適應環境時在每臂都放置食物，小鼠自由攝取食物180 s。開始訓練后，只在迷宮的4個臂放置食物(1、2、4、6臂)，并貼信號圖片，維持此順序至實驗結束。起初先將小鼠置于迷宮中央區的透明艙內， 15 s后撤除透明艙，讓小鼠自由覓食，待180 s末或動物完成所有放食臂的覓食時作為一次訓練結束。檢測的指標為：①工作記憶錯誤(working memory errors，WME)：小鼠在同一次訓練中第二次或多次進入已經吃過食物的臂；②參考記憶錯誤(reference memory errors, RME)：小鼠進入無食物臂；③錯誤總數(total errors，TE)：180 s內的錯誤總數；④潛伏期(total reaction times，TT)：小鼠完成一次訓練所用時間。當連續5次TE≤1，同時WME=0則可視為訓練成功(連續訓練25 d)。

2.2 動物分組及給藥方式

從訓練成功的小鼠中挑選出50只隨機分為5組(常氧對照組，缺氧模型組，毛蕊花苷低、中、高劑量組)，每組10只。自分組起，毛蕊花苷低、中、高劑量組分別給予50、 150、300 mg/kg藥物灌胃，常氧對照組和缺氧模型組給予等體積的蒸餾水(0.1 ml/10 g)灌胃，連續7 d，1次/d。

2.3 高原低壓低氧模型的制備

給藥第4 天，用八臂迷宮測試系統測試各組小鼠的WME、RME、TE及TT，每只測試2次，取平均值。測試后，常氧對照組置于飼養室(海拔約1 500 m)，剩余各組置于大型低壓氧艙中，模擬海拔7 500 m 高原環境(艙內壓力：35.9 kPa，氧分壓：8.0 kPa)，每天上午9點以2 m/s勻速下降至4 000 m(艙內壓力：62.1 kPa，氧分壓：13.0 kPa)，實驗員進入在艙內灌胃給藥并加水補食，連續3 d。給藥結束后，將低壓氧艙以2 m/s勻速上升至7 500 m，在氧艙中的小鼠可自由飲水、攝食。

2.4 八臂迷宮實驗測定小鼠空間記憶能力

第7天，對5組小鼠進行八臂迷宮測試(在海拔4 000 m低壓氧艙內進行)，記錄各組小鼠WME、RME、TE及TT，每只測試2次，取平均值。對照前后2次測試結果，考察在高原缺氧環境下毛蕊花苷對小鼠記憶損傷的改善作用。

2.5 血漿和腦組織MDA、GSH含量、T-SOD活力、腦組織ROS含量測定

各組小鼠八臂迷宮測試完畢后，眼球取血，脫臼處死。在冰盤上剝取腦組織。BCA法測定腦組織勻漿蛋白含量，按試劑盒說明書測定血漿和腦組織的MDA、GSH含量和T-SOD活力，腦組織ROS含量。

2.6 統計學分析

3 實驗結果

3.1 毛蕊花苷對高原記憶損傷小鼠八臂迷宮測試結果的影響

與常氧對照組比較， 缺氧模型組WME、RME、TE及TT分別增加933%、294%、390%和157%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組WME、RME、TE及TT分別降低58.1%、59.7%、59.2%及46.3%(P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組WME、RME、TE及TT分別降低54.8%、56.7%、56.1%及42.5%(P<0.01)；毛蕊花苷低劑量組TT降低27.6%(P<0.05)，見表 1。

表1 毛蕊花苷對小鼠八臂迷宮測試結果的影響

**P<0.01，與常氧對照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

3.2 毛蕊花苷對小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS的影響

與常氧對照組比較， 缺氧模型組小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS含量分別增加74.8%、122%和92.2%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS含量分別降低31.7%、34.7%和32.8%(P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組小鼠腦組織MDA和ROS含量分別降低30.2%和23.2%(P<0.01)，見表2。

3.3 毛蕊花苷對小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力的影響

與常氧對照組比較，缺氧模型組小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力分別降低32.4%、36.8%、18.7%和31.6%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力分別升高39.0%、51.6%、20.5%及37.8%(P<0.05，P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組小鼠血漿GSH含量、T-SOD活力和腦組織GSH含量分別升高34.5%、16.4%及48.3%(P<0.05，P<0.01)，見表 3。

表2 毛蕊花苷對小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS的影響

**P<0.01，與常氧對照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

表3 毛蕊花苷對小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力的影響

*P<0.05，**P<0.01，與常氧對照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

4 討論

學習記憶的能力直接反映了大腦作為高級中樞對其他組織器官信息的整合能力。高原缺氧使得進入該環境的人產生不同程度的腦損傷，導致記憶功能障礙，作業效能下降。研究發現，高原低壓低氧暴露能改變人的睡眠模式，增加覺醒次數；使人變得壓抑、焦躁；分散注意力，降低記憶力和執行力[10]。

本實驗中，八臂迷宮測試結果顯示，缺氧模型組小鼠的WME、RME、TE和TT與常氧對照組相比明顯升高，表明高原缺氧的確造成了動物的記憶損傷。給予毛蕊花苷干預后，各組WME、RME、TE和TT相比于缺氧模型組則有顯著降低，表明毛蕊花苷確實對高原缺氧記憶損傷有改善作用。

高原缺氧環境可激發機體氧化應激反應，組織中的氧自由基和氮自由基生成增多，進一步造成器官損傷。腦組織(特別是大腦皮質、海馬和紋狀體)抗氧化系統非常薄弱，對氧異常敏感。本實驗通過對血漿和腦組織MDA、GSH含量、T-SOD活力和腦組織ROS含量進行測定，結果表明氧化應激可能是引起神經元損傷的重要因素之一。相比而言，毛蕊花苷干預后，血漿和腦組織中的ROS、MDA含量顯著降低，GSH含量、T-SOD活力明顯升高，提示毛蕊花苷對高原缺氧小鼠記憶損傷的改善作用可能是通過穩定機體抗氧化酶系統的平衡，減輕氧化應激來實現的。

本實驗選擇毛蕊花苷低(50 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)3個劑量組灌胃給藥，考察毛蕊花苷對小鼠高原缺氧記憶損傷改善作用的量-效關系。結果顯示，低劑量組八臂迷宮測試和氧化應激指標大多與缺氧模型組無統計學差異，可能是因為劑量未達到最小有效量。中、高劑量組的各項指標顯示毛蕊花苷的確有較好的抗高原缺氧記憶損傷的效果。

綜上所述，毛蕊花苷對高原缺氧記憶損傷改善作用的機制之一可能是穩定機體抗氧化酶系統的平衡、減輕氧化應激，是否還有其他機制尚待研究。