用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量

常瑞蕊，陳衛(wèi)東，周婷婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 233000；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，上海 200433)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí),具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒以及消腫止痛的功效[1]，臨床上常用于糖尿病、抑郁癥、高脂血癥、炎癥及絕經(jīng)后綜合征[2-4]。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸酯、黃酮類以及二萜色素等成分[5]。其中，環(huán)烯醚萜苷類化合物為主要成分，該類成分具有利膽、保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[6]。

目前，梔子的質(zhì)量控制多采用高效液相色譜法[7]、超高效液相色譜法[8]或者高效薄層色譜法[9]等對(duì)梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、山梔苷等環(huán)烯醚萜苷類成分進(jìn)行定量分析，但是上述方法均存在分析時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度和分辨度低等缺點(diǎn)。液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)是一種液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的技術(shù)，其將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)結(jié)構(gòu)測(cè)定功能相結(jié)合[10]，其中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)具有更高的靈敏度和更強(qiáng)的選擇性。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法同時(shí)測(cè)定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分：山梔苷、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷的含量，不僅能縮短分析時(shí)間、提高分析效率，而且利用質(zhì)譜的高分辨率和高靈敏度，對(duì)梔子中含量較少的山梔苷進(jìn)行準(zhǔn)確定量，為梔子質(zhì)量控制提供更全面的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Shinmadzu 8040島津液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)，包括兩臺(tái)LC-30A色譜泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-30A柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器和一臺(tái)8040三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；CR3i高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)；XS205精密天平(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)。

梔子藥材(上海童涵春堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：江西)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品山梔苷(批號(hào)：17090822，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)，京尼平龍膽雙糖苷(批號(hào)：M0502AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，梔子苷(批號(hào)：G1910050，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，純度≥98%)；色譜純乙腈(美國(guó)Honeywell公司)，乙酸(美國(guó)Tedia公司)；超純水通過(guò)Milli-Q系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Dikma Diamonsil?C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.1%乙酸水(A)-0.1%乙酸乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～1 min，22%～35% B；1～4 min，35% B；4～5 min,35%～22% B。流速0.4 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積2 μl，分析時(shí)間5 min。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源(ESI)，正/負(fù)離子檢測(cè)，掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。正離子檢測(cè)模式下，京尼平龍膽雙糖苷m/z573.40→365.05，碰撞電壓：-34 eV；負(fù)離子檢測(cè)模式下，山梔苷m/z391.10→149.30，碰撞電壓：28 eV；梔子苷m/z447.30→225.15，碰撞電壓：14 eV。霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量15 L/min，脫溶劑管溫度 240 ℃，加熱塊溫度400 ℃，碰撞氣壓力230 kPa。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取山梔苷5.38 mg、京尼平龍膽雙糖苷5.16 mg、梔子苷2.50 mg，用初始流動(dòng)相定容至5 ml容量瓶中，搖勻，分別得到濃度為1.08、1.03和0.50 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取梔子藥材粉末0.5 g，用50%乙腈定容至10 ml容量瓶中，搖勻，將粗提物以12 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，精密吸取續(xù)濾液100 μl，用50%乙腈定容至100 ml容量瓶中，得梔子供試品溶液，備用。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取“2.3”項(xiàng)下混和對(duì)照品溶液，分別逐級(jí)稀釋，按照“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件，進(jìn)樣2 μl，記錄各對(duì)照品的濃度。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X，ng/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，山梔苷：Y= 243.810X-289.957，r=0.999 9，線性范圍10.76～215.2 ng/ml；京尼平龍膽雙糖苷：Y= 137.125X+2 092.76，r=0.999 6，線性范圍516～4 128 ng/ml；梔子苷：Y= 2 030.32X+823 213，r=0.999 8，線性范圍2 000～20 000 ng/ml。以上結(jié)果表明，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷濃度分別為53.8、2 064、10 000 ng/ml的混合對(duì)照品溶液。按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件，于同一天重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD分別為1.33%、0.93%和1.06%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(編號(hào)：20180627)，于室溫下分別放置0、2、4、6、8 h后，按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果顯示，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD分別為1.74%、1.09%和0.59%，表明供試品溶液在室溫條件下穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批藥材粉末0.5 g(編號(hào)：20180627,山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷的含量分別為0.06%、3.76%、12.45%)，按“2.4”項(xiàng)下處理后，按照“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄峰面積，平行實(shí)驗(yàn)5次，結(jié)果顯示，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD依次為1.36%、1.44%、1.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的梔子藥材粉末0.5 g(編號(hào)：20180627)，按“2.4”項(xiàng)下處理后，按各成分在原藥材中的含量，分別精密加入相同含量和濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，測(cè)定回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別稱取3批不同批次的梔子樣品粉末，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”、“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，每份溶液進(jìn)樣3次，計(jì)算山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 3種待測(cè)物的MRM色譜圖 A.空白乙腈溶劑；B. 3種待測(cè)物混合對(duì)照品；C.梔子粉末樣品1.山梔苷；2.京尼平龍膽雙糖苷；3.梔子苷

圖2 3種待測(cè)物的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖 A.山梔苷；B.京尼平龍膽雙糖苷；C.梔子苷

化合物樣品量(m/g)原有量(m/mg)加入量(m/mg)測(cè)得量(m/mg)平均回收率(%)RSD(%)山梔苷0.500 90.360.400.78103.731.770.500 40.370.400.760.500 20.380.400.770.500 50.400.400.810.500 00.390.400.790.500 40.420.400.82京尼平0.500 920.8620.0042.18102.021.40龍膽雙0.500 421.7520.0042.07糖苷0.500 219.7020.0039.990.500 520.0720.0041.810.500021.7920.0041.030.500 422.2220.0040.88梔子苷0.500 969.1465.00135.80102.961.050.500 465.8565.00134.520.500 266.7965.00134.730.500 565.7465.00135.910.500 065.6965.00133.680.500 967.2365.00134.56

表2 不同批次梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量

3 討論

3.1 檢測(cè)離子的選擇

目前，在國(guó)內(nèi)外關(guān)于環(huán)烯醚萜苷類成分的質(zhì)譜檢測(cè)條件的報(bào)道中，一級(jí)質(zhì)譜多以負(fù)離子模式下的[M-H]-為主[11-12]。由于不同儀器的響應(yīng)和靈敏度不同，本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子模式對(duì)山梔苷和梔子苷進(jìn)行檢測(cè)，采用正離子模式對(duì)京尼平龍膽雙糖苷進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于一級(jí)質(zhì)譜碎片離子的選擇，山梔苷為[M-H]-，梔子苷為[M+CH3COO]-，京尼平龍膽雙糖苷為[M+Na]+。在二級(jí)質(zhì)譜中，山梔苷的碎片離子選擇[M-H-O-Glu-COOH]-，梔子苷的碎片離子選擇[M+CH3COO-Glu-C2H2-OH]-，京尼平龍膽雙糖苷的碎片離子選擇[M+Na-Glu-CO]+。先前報(bào)道表明環(huán)烯醚萜苷類成分在二級(jí)質(zhì)譜中糖基易斷裂[13-14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道相符。

3.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈和甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時(shí)，色譜分離效果更好，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度更高，為了增強(qiáng)響應(yīng)值、縮短分離時(shí)間，選擇乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相中添加0.1%甲酸和0.1%乙酸對(duì)離子化響應(yīng)度和分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中添加0.1%乙酸的離子化響應(yīng)度以及分離效果更好，故選擇0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)LC-MS/MS測(cè)定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法具有較寬的線性范圍，并且3種物質(zhì)在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)(r>0.999)；與此同時(shí)，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率的RSD均<2%，符合分析方法的要求。以上方法學(xué)考察數(shù)據(jù)顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的方法靈敏可靠，可用于測(cè)定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量。