D-半乳糖致認(rèn)知障礙整體及離體模型的建立和評估

洪 辰，胡文君，王淑娜，李志勇，繆朝玉

(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433)

認(rèn)知是機(jī)體認(rèn)識和獲取知識的智能加工過程，涉及學(xué)習(xí)、記憶、語言、思維、精神、情感等行為。認(rèn)知障礙指與上述學(xué)習(xí)記憶以及思維判斷有關(guān)的大腦高級智能加工過程出現(xiàn)異常，從而引起學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，任何引起大腦功能和結(jié)構(gòu)異常的因素均可能導(dǎo)致認(rèn)知障礙。隨著人類壽命的延長，認(rèn)知功能下降逐漸成為老齡化人群最嚴(yán)重的健康威脅之一，也給社會及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[1]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，2010年我國癡呆的患病人數(shù)為919萬人，患病率約為9.87‰，其中阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)患者569萬人，患病率為6.25 ‰[2]。但是到目前為止，研究者們對于這些伴有認(rèn)知障礙的疾病，如AD、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington′s disease, HD)、血管性癡呆(vascular dementia, VD)以及帕金森病(Parkinson′s disease, PD)等的病因和發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，對于有效治療和緩解認(rèn)知障礙的藥物也需要進(jìn)行深入研究。所以，建立有效的整體動物和細(xì)胞水平的模型對于疾病研究和藥物研發(fā)都有十分重要的意義。

D-半乳糖[D-(+)galactose, D-gal](圖 1)致認(rèn)知障礙模型主要原理是過量的D-gal代謝產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)蓄積，使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，對生物體造成氧化應(yīng)激損傷，而該損傷則模擬動物的老化過程，造成生物體認(rèn)知功能下降。海馬區(qū)是與學(xué)習(xí)記憶功能聯(lián)系最為緊密的區(qū)域之一，并且是成年個體大腦中少數(shù)可以產(chǎn)生新生神經(jīng)元的區(qū)域[3-4]，所以，直接在海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞層面進(jìn)行干預(yù)可以得到與認(rèn)知功能相關(guān)的更有意義和說服力的結(jié)論。根據(jù)目前的文獻(xiàn)報道，鮮有將D-gal整體及離體模型聯(lián)合應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制及藥效學(xué)評價過程，特別是針對海馬區(qū)神經(jīng)元的D-gal離體模型較少受到關(guān)注。所以，確立這兩種模型穩(wěn)定的建立方法并對其功能進(jìn)行評估，確定其聯(lián)合應(yīng)用的可行性，將會在新藥研發(fā)以及闡明認(rèn)知功能下降機(jī)制等研究領(lǐng)域發(fā)揮一定的積極作用。同時，對于用于檢測嚙齒類動物的學(xué)習(xí)和記憶功能的經(jīng)典Morris水迷宮實驗，目前僅有實驗方法的報道，鮮有文獻(xiàn)介紹該動物行為學(xué)實驗的細(xì)節(jié)和經(jīng)驗，本實驗室根據(jù)目前已報道的實驗方法進(jìn)行了多次實驗，也總結(jié)得出一些實踐經(jīng)驗。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

D-gal購自生工生物工程(上海)股份有限公司(產(chǎn)品編號：A600215-0025)；分子指標(biāo)檢測試劑盒包括Caspase-3、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、CCK8，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號：C1116、S0131、S0101、S0056、C0037)；Neurobasal A 培養(yǎng)基、B27+Vitamin A supplement及GlutaMAX均購自Invitrogen公司(貨號：10888022、17504044、35050-061)；Accutase酶及青霉素-鏈霉素購自Gibco公司(貨號：A11105-01、15140122)；高糖DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司(貨號：SH30243.01)。

1.2 儀器與設(shè)備

Morris水迷宮實驗采集分析系統(tǒng)(型號：XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司)；M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號：Neofuge13R，上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級7周齡C57BL/6J小鼠及生后1 d幼鼠(海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。實驗動物飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)動物房，自由飲水、進(jìn)食，溫度(23±2) ℃，相對濕度40%～60%，噪聲≤60 dB，采用人工照明，晝夜均為12 h；生后第1 天的幼鼠當(dāng)天進(jìn)行實驗。實驗方案遵守動物福利、動物倫理及動物保護(hù)等相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 分組與處理

C57BL/6J小鼠Morris水迷宮實驗：7周齡實驗動物在動物房適應(yīng)環(huán)境1周后，根據(jù)性別分組，進(jìn)行Morris水迷宮實驗。C57BL/6J小鼠制備D-gal模型：7周齡雌性小鼠在動物房適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為模型組和對照組，模型組連續(xù)腹腔注射D-gal生理鹽水溶液8周，劑量為100 mg/kg；溶劑對照組連續(xù)腹腔注射10 ml/kg體積的生理鹽水溶液8周[5]。C57BL/6J小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞制備體外D-gal模型：將體外培養(yǎng)生長第8天的海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和實驗組，實驗組給予不同濃度的D-gal，對照組則采用無藥物培養(yǎng)基，兩組均處理48 h。

2.2 Morris水迷宮實驗

基于Vorhees的實驗方法[6]，課題組對某些細(xì)節(jié)做出修改，簡述如下：在黑色水盆(直徑120 cm、高35 cm)內(nèi)注水，維持水溫在(22±1) ℃；將水染成白色并人為劃分成4個象限，在其中一個象限中固定一個直徑為10 cm的透明平臺，平臺高度保持在水平面以下1 cm；水池用簾布遮擋，懸掛方向標(biāo)志物。實驗連續(xù)進(jìn)行，共計6 d，1～5 d是空間采集實驗，第6天是探測實驗。在1～5 d，動物從盆壁4個固定位置面對盆壁入水，如果60 s內(nèi)未找到隱藏在水下的平臺，則引導(dǎo)動物到平臺并停留20 s；第6天，撤去平臺，動物從平臺所在象限的對側(cè)盆壁最遠(yuǎn)處入水。由視頻跟蹤監(jiān)測系統(tǒng)自動記錄相關(guān)信息后對參數(shù)進(jìn)行分析。

2.3 小鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)元培養(yǎng)

將C57BL/6J出生第1天的幼鼠(P0～P1)預(yù)先在冰冷的75 %乙醇中處死，隨后斷頭取腦，在顯微鏡下于冰冷的高糖DMEM培養(yǎng)液中分離海馬區(qū)，去掉軟腦膜，之后將海馬組織剪碎，用Accutase酶消化，置于37 ℃搖床中消化10 min后，加入FBS(終濃度為10%即可)終止消化。隨后在離心機(jī)中以1 000 r/min離心5 min，用接種培養(yǎng)基(含20 %FBS的高糖DMEM溶液)重懸后通過40 μm尼龍濾器去除組織碎片，以獲得單個細(xì)胞，再用接種培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，最后以250 μl/孔的細(xì)胞懸浮液接種在48孔板中或者以2 000 μl/孔的細(xì)胞懸浮液接種在6孔板中[活細(xì)胞密度為4×105個/ml，孔板預(yù)先用聚-D-賴氨酸(PDL)包被過夜]，并在接種4～6 h后更換成生長培養(yǎng)基(Neurobasal A 培養(yǎng)基中添加50×B27+Vitamin A 細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，0.5 %谷氨酰胺添加劑和1 %的青霉素-鏈霉素)。接種后隔天換液，并在接種后第3天加入阿糖胞苷(終濃度為2.5 μg/ml)處理48 h抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，接種后第7天進(jìn)行海馬神經(jīng)元純度鑒別(神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Tuj-1)，保證神經(jīng)元比例≥90%，在接種后第8天進(jìn)行干預(yù)[7]。

2.4 分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測

Caspase3、 丙二醛(MDA)、 總超氧化物歧化酶 (SOD)、 谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-px)的檢測嚴(yán)格按照試劑盒提供的方法和步驟進(jìn)行； CCK8則按照1∶10的比例將試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)基中， 37 ℃孵育1 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)除Morris水迷宮空間采集實驗采用(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)之外，其余均采用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)；兩組之間比較時，計量資料數(shù)據(jù)采用t檢驗，計數(shù)資料采用Mann-Whitney U秩和檢驗，多組計數(shù)資料則采用One-way ANOVA并Dunnett-t檢驗；以P<0.05時為兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 C57BL/6J小鼠Morris水迷宮實驗

從1～5 d的空間采集實驗結(jié)果可見(圖2A)，自第2天起，雄性小鼠到達(dá)平臺的潛伏期始終短于雌性小鼠，但是兩組小鼠到達(dá)平臺期的時間并無統(tǒng)計學(xué)差異；在第6天的探測實驗中可以發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠穿越平臺的次數(shù)以及在平臺所在象限停留的時間均高于雌性小鼠(圖2B、圖2C)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從實驗結(jié)果可以看出，按照規(guī)定的實驗方法能夠觀察到生理狀態(tài)下C57BL/6J小鼠的學(xué)習(xí)曲線，兩種性別小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力接近。

3.2 C57BL/6J小鼠制備D-gal模型Morris水迷宮實驗

從1～5 d的空間采集實驗結(jié)果可見，在第4天和第5天兩組小鼠到達(dá)平臺的潛伏期存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，給予D-gal的模型組小鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組(圖3 A)，說明模型組小鼠的學(xué)習(xí)能力較差；在第6天的探測實驗中可以發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠在平臺所在象限停留的時間明顯短于對照組(P<0.05，圖3B)，但兩組在穿越平臺次數(shù)指標(biāo)中未見明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(圖3 C)，說明模型組動物的記憶功能也較差。

3.3 C57BL/6J小鼠制備D-gal模型相關(guān)分子生物學(xué)指標(biāo)檢測

在腦組織蛋白水平上的檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中的凋亡通路Caspase-3酶的含量(P<0.001，圖4A)、MDA的含量(P<0.05，圖4B)以及GSH-px的含量(P<0.05，圖4C)均明顯高于對照組，說明D-gal促進(jìn)模型組小鼠神經(jīng)元的凋亡、造成模型組腦組織脂質(zhì)過氧化損傷，但兩組小鼠腦組織中SOD的含量(圖4 D)并無明顯差異。上述實驗結(jié)果證明，采用D-gal制備小鼠老化致癡呆模型成功，D-gal可以損害動物的學(xué)習(xí)和記憶功能。

圖3 D-gal模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能A.1～5 d到達(dá)平臺的潛伏期；B.第6天穿越平臺所在象限時間；C.第6天穿越平臺次數(shù)*P<0.05，與對照組比較

圖4 D-gal模型小鼠腦組織的細(xì)胞凋亡水平和氧化應(yīng)激損傷A.Casepase-3含量；B. MDA含量；C.GSH-px含量；D.SOD含量*P<0.05，***P<0.001，與對照組比較

3.4 C57BL/6J小鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)元制備D-gal模型分子生物學(xué)指標(biāo)檢測

實驗結(jié)果表明，經(jīng)D-gal處理后的小鼠海馬神經(jīng)元，在藥物作用48 h以后(圖5)不同劑量的給藥組與對照組相比較，從3 mg/ml濃度開始，各組細(xì)胞活力均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05或P<0.001)，與此同時，在30 mg/ml的劑量時可以出現(xiàn)肉眼可見的神經(jīng)元形態(tài)改變，包括神經(jīng)元數(shù)量以及神經(jīng)突觸減少，而在100 mg/ml的劑量時神經(jīng)元只殘存胞體，幾乎看不到神經(jīng)突觸的存在，可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用(圖6)。在神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激分子指標(biāo)上的實驗結(jié)果顯示，與對照組相比,各濃度梯度的D-gal刺激均可以產(chǎn)生對神經(jīng)元的損傷作用。其中, GSH-px各劑量組和對照組相比均有明顯差異(P<0.01或P<0.001，圖7 A)，但是SOD的含量與對照組相比，沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖7 B)，與之前在整體模型中得出的結(jié)論一致。上述實驗結(jié)果證明，采用D-gal制備的小鼠離體神經(jīng)元損傷模型成功，D-gal可以對神經(jīng)元造成細(xì)胞毒性以及氧化應(yīng)激損傷。

圖5 不同D-gal濃度孵育48 h后對小鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞毒性損傷作用*P<0.05，***P<0.001，與0 mg/ml組比較

4 討論

隨著社會人口老齡化的加快，越來越多的老年人出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。到目前為止，由衰老及其他疾病引發(fā)的認(rèn)知功能下降的機(jī)制仍有待闡明[1]，同時，尚無一個公認(rèn)有效的可以改善認(rèn)知功能的藥物問世[8]。所以，建立有效的可以進(jìn)行機(jī)制研究和新藥研發(fā)的整體及離體模型顯得尤為重要。D-gal模型是老年型癡呆的藥效學(xué)研究模型，屬于老化致癡呆模型的一個亞型。該模型的優(yōu)勢在于可以模擬正常個體衰老過程出現(xiàn)的認(rèn)知障礙，方法簡便易行，模型周期相對較短，并可適用于Morris水迷宮、Y迷宮、曠野實驗、回避實驗、高架十字迷宮等多種動物行為學(xué)實驗[9]，但是，氧化應(yīng)激致衰老并非認(rèn)知功能下降的唯一原因，所以該模型的使用也存在一定程度的局限。D-gal離體神經(jīng)元模型可以彌補D-gal整體動物模型在機(jī)制研究和藥物評價上的不足，其模型方法簡單，相比整體動物模型而言，離體模型直接作用于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，且造模時間短，更適用于機(jī)制、分子水平和調(diào)控通路的研究。

圖6 不同D-gal濃度孵育48 h后對小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響

而聯(lián)合應(yīng)用整體及離體模型的方法，可以互相取長補短，除了可以驗證不同的動物表型，還可以進(jìn)行藥效學(xué)實驗。但由于D-gal本身具有一定的毒性作用，根據(jù)文獻(xiàn)報道[10]和實驗結(jié)果，本實驗室認(rèn)為在D-gal整體動物模型中以100 mg/kg為推薦劑量，造模時間為8周，在這個劑量及時間下既可以出現(xiàn)明顯的損傷效應(yīng)，又不會導(dǎo)致不同組之間的實驗動物出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能下降從而引起表型差異不明顯的情況發(fā)生；而D-gal離體細(xì)胞模型中以10 mg/ml為推薦劑量，48 h為推薦的造模時間，在此劑量及時間下，細(xì)胞可以出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷但是沒有明顯的形態(tài)學(xué)改變，不影響后續(xù)結(jié)果的檢測。

根據(jù)目前的文獻(xiàn)報道，鮮有將D-gal整體及離體模型聯(lián)合應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制及藥效學(xué)評價過程，所以本研究方法將兩者結(jié)合應(yīng)用可能會在新藥研發(fā)以及闡明認(rèn)知功能下降機(jī)制等研究領(lǐng)域發(fā)揮一定的積極作用。

經(jīng)過多次Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，在前2天的訓(xùn)練過程中，可適當(dāng)延長動物在平臺上的停留時間至20 s，以便給動物更多的時間對周圍環(huán)境和空間線索進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶。與此同時，在實驗過程中需要密切監(jiān)視每只受試動物的行為表現(xiàn)，由于每只動物每天共進(jìn)行4次實驗，對于明顯不符合其他3次實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)可以考慮進(jìn)行重新檢測。對于在不同訓(xùn)練日出現(xiàn)波動甚至相反實驗結(jié)果的實驗個體可以考慮剔除或者增加訓(xùn)練次數(shù)。對于個別始終找不到平臺的動物，除了考慮其認(rèn)知功能確實下降之外，還應(yīng)綜合考慮水溫、環(huán)境等外界因素對動物行為本身的干擾，特別是水溫對于受試動物的行為影響較大。由于動物行為學(xué)實驗數(shù)據(jù)存在的波動性較大，針對D-gal模型，根據(jù)薈萃分析的報道[11]，有1%的文獻(xiàn)采用不同動物行為學(xué)方法聯(lián)合檢測，包括Y迷宮、穿梭箱等，雖然所占比例較低，但是不失為一個優(yōu)選策略。聯(lián)合應(yīng)用動物行為學(xué)方法可以考察不同方面的認(rèn)知功能以互補長短，使結(jié)果更具有說服力。