孫 凱 劉麗駿 張倩倩 蔣偉文

衰老是隨著年齡的增大，生物發生的結構功能開始發生退行性變的一種趨向死亡的不可逆轉的現象[1]。目前，針對全身衰老的研究是國際研究的熱點。學者們已建立了多種全身衰老的動物模型，揭示了衰老相關的分子機制和信號通路，并發現針對其進行相關干預可以延長動物壽命。與成熟的全身衰老研究相反，衰老與口腔黏膜疾病的機制研究并沒有引起足夠關注。實際上，衰老對口干癥等口腔疾病的發生密切相關[2]，而口干則會繼發牙周病、根面齲等疾病，出現牙齒松動脫落或冷熱酸痛等癥狀，影響進食，從而對全身營養攝入產生不利影響。遺憾的是，國內外尚無針對口腔黏膜衰老的動物模型。因此，建立一個口腔黏膜衰老的動物模型，為防治口腔黏膜衰老相關疾病提供工具,具有很強的科學意義。

目前，學者們對口腔黏膜上皮增齡性改變的結論并不一致。Scott等發現隨著年齡增加，人舌腹被覆黏膜上皮厚度減少約30%左右[3]。Sakai等發現在鼠牙齦細胞和結合上皮細胞并沒有增齡性變化[4]。理論上說，采用自然衰老鼠進行衰老研究最符合人類衰老的特點。在大鼠的生長過程中，其月齡與人年齡有著對應的關系(表1)。目前，老年動物飼養周期長和易死亡是其模型建立的兩大瓶頸。據此，我們擬研究Wistar大鼠自然衰老過程中口腔頰黏膜上皮厚度的改變，為口腔黏膜人工衰老模型的后期開發提供自然衰老鼠的對照數據。

表1 大鼠月齡與人年齡對應關系圖

1.材料和方法

1.1 材料 實驗鼠選用雄性Wistar大鼠。3月齡鼠3只，作為青年組；12月齡鼠3只，作為中年組；24月齡鼠3只，作為老年組。本研究所涉及大鼠均來源和飼養于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心[使用許可合格證號SYXK(滬)2012-0007]。飼料選用有生產許可證的商品飼料，經Co60消毒后使用。飲用水為無菌過濾水。設施內動物換氣次數每小時8～15次，氨濃度＜20ppm，相對濕度40%～80%，濾過后空氣潔凈度為10000級，噪聲＜50dB，溫度20℃～23℃。本研究已獲上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會批準[倫理號：滬科動倫(2018)59]。

1.2 方法 將Wistar大鼠飼養至相應月齡后，稱取體重，按0.4ml/100g的劑量于腹腔注射水合氯醛進行麻醉。待麻醉起效后，取鼠口腔自口角向內的頰黏膜組織，大小約為1cm×1cm，深度5mm，放入福爾馬林中浸泡24h，石蠟包埋，4μm切片，行蘇木精伊紅(Hematoxylin/Eosin，HE)染色。染色具體步驟為：蘇木精染色2min；流水沖洗2min；1%鹽酸酒精作用2s；流水沖洗10s；氨溶液復藍15s；流水沖洗5min；80%酒精作用20s；1%伊紅液染色15s；95%酒精作用20s；95%酒精作用20s兩次；二甲苯作用3min兩次。

將HE染色載玻片于正置顯微鏡下400倍放大的視野中觀察，每張玻片隨機取5個視野，測量自上皮釘突處基底層底端至粒層頂端的厚度和自粒層頂端至角化層頂端的厚度(圖1)，該兩項指標分別代表了上皮增殖和成熟的能力。

圖1 上皮厚度主要觀察指標示例

1.3 統計學分析 我們采用了SPSS17.0軟件進行數據統計，三組間比較首先進行方差齊性分析。如方差齊采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，結果用均數±標準差表示。如方差不齊采用非參數檢驗，結果用中位數±四分位數間距表示。P＜0.05代表差異具有顯著性。

2.結果

通過對Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮進行的HE染色發現，老年組的上皮角化層、粒層的層數大于青年組或中年組，青年組和中年組之間差異不明顯(圖 2)。

老年組的Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮基底層至粒層平均厚度為125.1±34.4μm，中年組的平均厚度為77.2±51.0μm，青年組的平均厚度為65.9±27.4μm，老年組顯著高于青年組(P＜0.001)和中年組(P=0.004)(圖3A，單因素方差分析)。

同樣地，在鼠上皮角化層方面，老年組的平均厚度為50.1±31.1μm，中年組的平均厚度為16.3±15.4μm，青年組的平均厚度為16.4±12.5μm，老年組顯著高于青年組(P＜0.001)和中年組(P＜0.001)(圖3B，單因素方差分析)。

圖2 Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮HE染色(×400)

圖3 上皮厚度的增齡性變化散點圖

3.討論

目前，口腔黏膜衰老的機制并不明確。口腔黏膜衰老鼠模型可為口腔黏膜衰老機制的研究提供新的工具。然而，老年自然衰老鼠具有飼養周期長的缺點，而現成的老年鼠不易獲得。本研究自上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心購買得目前市場上能夠得到的年齡最大的12月齡Wistar大鼠，并將其飼養12月從而獲得24月齡老齡鼠。因此，本研究獲得老年鼠的上皮厚度的增齡性變化數據顯得十分珍貴。

十年前，巴西學者曾研究了雌性家鼠舌背這一黏膜上皮厚度的增齡性變化[5]，發現角化層厚度在中年和老年鼠中顯著高于青年組，這與本研究在頰黏膜中的結果一致，可能與老年鼠進食時間較長所引起的過角化有關。不同的是，巴西學者發現基底層至粒層厚度隨月齡增加出現降低的趨勢，而我們則發現隨月齡增加出現升高的趨勢，這可能與取材黏膜類型和實驗鼠種類不同有關。

本研究仍有一定的局限性，如青年、中年、老年鼠數量各僅有3只，增加了結果的不確定性，今后可適當增加每組樣本數量。在時間分布上，許多研究僅設置2個研究時間點[6-8]，即青年和老年，本研究觀察的時間點為3個，今后的研究可再適當增加觀察時間點，以獲得更有月齡連續性的統計數據。目前，人工衰老鼠模型包括D-半乳糖給藥法、臭氧損傷法和去除胸腺法等的研究已較為成熟，未來可嘗試進行人工衰老造模，以期獲得更多的口腔黏膜衰老研究工具。