紫皮石斛西洋參顆粒的研制及增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)

吳月國(guó)，趙錚蓉，張萍，趙菊潤(rùn)，劉驊，*

（1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310013；2.龍陵縣石斛研究所，云南保山678300）

紫皮石斛為蘭科植物齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxton.）的干燥莖，又名齒瓣石斛，收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，具有益胃生津，滋陰清熱等功效[1]，為我國(guó)西南各省區(qū)主要習(xí)用品種之一，石斛中的佳品[2-4]。近期，云南省衛(wèi)計(jì)委發(fā)布了紫皮石斛的食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)已屬于藥食兩用管理的石斛品種。作為迄今唯一由行政主管部門發(fā)布食品安全標(biāo)準(zhǔn)的石斛品種，紫皮石斛無(wú)疑將步入發(fā)展的快車道。西洋參（Panax quinquefolium L.）具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津等功效[5-6]，收錄于衛(wèi)生部發(fā)布的保健食品可用目錄。紫皮石斛西洋參顆粒是以紫皮石斛復(fù)配西洋參，經(jīng)現(xiàn)代先進(jìn)工藝制成的顆粒劑，是擬以紫皮石斛為主要原料打造的高原特色產(chǎn)品。本研究考察了紫皮石斛西洋參顆粒的主要生產(chǎn)制備工藝，并評(píng)價(jià)其增強(qiáng)免疫力的保健功能，以期進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。

1 試驗(yàn)材料

無(wú)水葡萄糖、人參皂苷Re：中國(guó)食品藥品檢定研究院；苯酚：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；香草醛：上海雙喜香料助劑有限公司；乙酸：杭州化學(xué)試劑有限公司；高氯酸：金鹿化工有限公司；乙醇：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液：美國(guó)GIBCO公司；刀豆蛋白A：上海源葉生物科技服務(wù)有限公司；印度墨汁：南京都萊生物技術(shù)有限公司；綿羊血：金華利民試劑經(jīng)營(yíng)部；YAC-1細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

T6新世紀(jì)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；MAX190型紫外可見(jiàn)連續(xù)光譜酶標(biāo)儀：美國(guó)分子儀器公司；TD12001型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；AG285型電子天平：瑞士METTLER公司；XS205型電子天平：瑞士METTLERTOLEDO公司；DM4000BLED型熒光顯微鏡：德國(guó)萊卡公司。

鐵皮石斛：龍陵縣石斛研究所；西洋參：華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司；ICR小鼠：浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 紫皮石斛西洋參顆粒制備工藝研究

紫皮石斛西洋參顆粒由紫皮石斛復(fù)配西洋參，經(jīng)提取、濃縮、制粒、干燥等現(xiàn)代工藝精制而成，其中提取工藝步驟對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響最為關(guān)鍵，需重點(diǎn)考察。根據(jù)紫皮石斛和西洋參有效成分的化學(xué)性質(zhì)，分別通過(guò)正交試驗(yàn)考察用水提取和用乙醇提取對(duì)有效成分的影響，優(yōu)選紫皮石斛西洋參顆粒的提取工藝。

多糖是紫皮石斛的主要有效成分之一，具有增強(qiáng)免疫力的功能。多糖易溶于水，宜用水進(jìn)行提取，影響因素有加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等，故以加水量A（20倍、30倍、40倍）、煎煮次數(shù) B（1次、2次、3次）、煎煮時(shí)間C（3 h、4 h、5 h）為考察的因素和水平按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)[7-9]，以苯酚-濃硫酸法測(cè)粗多糖含量（以無(wú)水葡萄糖計(jì)）[5，10]，作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選紫皮石斛的最佳提取工藝。

西洋參富含皂苷，宜采用乙醇回流提取，影響西洋參回流提取的因素有乙醇濃度、乙醇用量、回流時(shí)間、回流次數(shù)等，故以乙醇濃度A（30%、50%、70%）、乙醇用量 B（20倍、30倍、40倍）、回流時(shí)間 C（1 h、2 h、3 h）及回流次數(shù)D（1次、2次、3次）為考察的因素和水平按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)[11-12]，以總皂苷含量（以人參皂苷Re計(jì)）[13]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選西洋參的最佳提取工藝。

確定提取工藝后，再參照中藥顆粒劑的制備方法，即濾液先減壓濃縮，濃縮液添加輔料制粒，干燥，整粒后得紫皮石斛西洋參顆粒，以苯酚-濃硫酸法測(cè)其粗多糖含量，按照《保健食品技術(shù)評(píng)價(jià)規(guī)范》2003年版中總皂苷的測(cè)定方法測(cè)定總皂苷含量。

2.2 紫皮石斛西洋參顆粒增強(qiáng)免疫力功能測(cè)定

2.2.1 小鼠分組

ICR 小鼠，SPF 級(jí)，均為雌性，體重 18 g～22 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2016-0010。實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件為：室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品技術(shù)評(píng)價(jià)規(guī)范》[13]和相關(guān)科學(xué)文獻(xiàn)[14-15]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)小鼠均被分為紫皮石斛西洋參顆粒低、中、高3個(gè)劑量組（0.5、1.0、3.0 g/kg）和陰性對(duì)照組（蒸餾水），每組10只。試樣灌胃體積為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2.2 小鼠臟器/體重比值的測(cè)定

連續(xù)灌胃給予試樣30 d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取其脾臟、胸腺稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%壓積綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）懸液，進(jìn)行免疫。免疫后4 d，測(cè)量左后足跖部厚度，然后于測(cè)量部位皮下再次注射20 μL20%SRBC懸液，24 h后再次測(cè)量左后足跖部厚度，計(jì)算攻擊前后足跖的厚度差值。

2.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

灌胃給予試樣30 d后，取脾臟制備單細(xì)胞懸液，分2孔加入24孔培養(yǎng)板中，一孔加刀豆蛋白A液，另一孔作為對(duì)照。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加RPMI1640培養(yǎng)液和噻唑藍(lán)液，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h加酸性異丙醇，使紫色結(jié)晶完全溶解。轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

2.2.5 抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL2%SRBC懸液進(jìn)行免疫，再灌胃給予試樣4 d后處死動(dòng)物，取脾制備單細(xì)胞懸液，按Jerne改良玻片法[15]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算溶血空斑數(shù)。

2.2.6 血清溶血素的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第26天，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC懸液進(jìn)行免疫。4 d后，摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，在微量血凝板內(nèi)與SRBC進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，觀察血球凝集程度，計(jì)算抗體積數(shù)。

2.2.7 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌胃給予試樣30 d后，按10 mL/kg體重計(jì)算，尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁。在注射后2、10 min從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，并將小鼠處死，取肝臟、脾臟稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)。

2.2.8 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第26天給每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC懸液。4 d后，每鼠腹腔注射加小牛血清的Hank's液3mL，處死小鼠，吸取腹腔洗液0.5 mL加入盛有0.5 mL 1%雞血紅細(xì)胞懸液的試管內(nèi)，混勻。吸取0.5 mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15 min后固定，Giemsa液染色15 min。沖凈，晾干，鏡檢，計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬指數(shù)。

2.2.9 NK細(xì)胞活性測(cè)定

灌胃給予試樣30 d后，取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，按乳酸脫氫酶測(cè)定法[15]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算NK細(xì)胞活性。

2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫皮石斛西洋參顆粒工藝優(yōu)選結(jié)果

乙醇提取正交試驗(yàn)結(jié)果顯示回流提取西洋參總皂苷的影響因素大小順序?yàn)椋篈>B>C>D，即乙醇濃度對(duì)提取率的影響最大，乙醇用量次之。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，并綜合考慮生產(chǎn)成本和生產(chǎn)效率，最終確定提取條件為：A3B2C3D1，即確定西洋參提取的最佳工藝參數(shù)是：用30倍量70%乙醇回流提取3 h。

水提正交試驗(yàn)結(jié)果顯示提取紫皮石斛粗多糖的影響因素大小順序?yàn)椋築>A>C，即煎煮次數(shù)對(duì)提取率的影響最大，加水量次之，煎煮時(shí)間對(duì)其影響相對(duì)最小。綜合試驗(yàn)結(jié)果、生產(chǎn)成本等，最終確定紫皮石斛水提的提取條件為：A2B2C2。因此可以確定紫皮石斛西洋參顆粒水提的工藝參數(shù)是：30倍量水，提取2次，每次4 h。

最終根據(jù)制備工藝試驗(yàn)結(jié)果，確定紫皮石斛西洋參顆粒的的生產(chǎn)工藝為：西洋參先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，濾渣再與紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，濾液經(jīng)減壓濃縮，添加輔料后流化床制粒、干燥。按照該工藝制備的紫皮石斛西洋參顆粒，經(jīng)檢測(cè)，粗多糖含量約為3%，總皂苷含量約為0.2%。

3.2 小鼠臟器/體重比值的測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒的3個(gè)劑量組小鼠脾臟/體重比值及胸腺/體重比值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。小鼠臟器/體重比值的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小鼠臟器/體重比值的測(cè)定結(jié)果（x±s）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（x±s）

3.3 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)4 d后再用SRBC攻擊時(shí)，攻擊部位會(huì)出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度，在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒中、高劑量組均能顯著增加小鼠左后足跖部24 h與0 h的厚度差值（P<0.05），表明細(xì)胞免疫功能陽(yáng)性。如表4所示，用ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，紫皮石斛西洋參顆粒3個(gè)劑量組與對(duì)照組比較光密度值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Table 2 Effect of the delayed type hypersensitivity（DTH）and the transformation level of lymphoid on mice（x±s）

3.4 小鼠抗體生成細(xì)胞和血清溶血素的測(cè)定結(jié)果

小鼠抗體生成細(xì)胞和血清溶血素測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒3個(gè)劑量組小鼠溶血空斑數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)SRBC免疫后的血清溶血素水平是反映小鼠體液免疫功能的重要指標(biāo)，在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒的3個(gè)劑量組都能顯著提高小鼠的抗體積數(shù)值，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明紫皮石斛西洋參顆粒能增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。

表3 小鼠抗體生成細(xì)胞和血清溶血素測(cè)定結(jié)果（x±s）Table 3 Effect of the number of antibody formation cell and the serum emolysin content on mice（x±s）

3.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Table 4 Effect of the carbon clearance index on mice（x±s）

如表4所示，與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒3個(gè)劑量組小鼠的吞噬指數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Table 5 Effect of the phagocytic ability of celiac macrophage on mice（x±s）

如表5所示，與對(duì)照組相比，各劑量均能有效提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，其中高劑量組顯著提高（P＜0.01），表明紫皮石斛西洋參顆粒能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力。

3.7 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果

小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果（x±s）Table 6 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（x±s）

如表6所示，活細(xì)胞胞漿內(nèi)的乳酸脫氫酶在正常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞殺傷后，乳酸脫氫酶會(huì)釋放到細(xì)胞外，在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒低劑量組NK細(xì)胞活性得到明顯升高（P＜0.05）。

4 結(jié)論

根據(jù)制備工藝試驗(yàn)結(jié)果確定了紫皮石斛西洋參顆粒的生產(chǎn)工藝。西洋參先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，濾渣再與紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，過(guò)濾，濾液再經(jīng)濃縮、制粒、干燥等步驟后可制備得到紫皮石斛西洋參顆粒劑產(chǎn)品。

紫皮石斛西洋參顆粒劑產(chǎn)品經(jīng)增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)水平和血清溶血素含量，增強(qiáng)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，升高NK細(xì)胞活性，可判定其具有增強(qiáng)免疫力的保健功能，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。