酪蛋白磷酸肽檢測方法研究進展

邵琪，魏麗娜，張東麗，張麗茹，王為，屈巖峰，*

（1.黑龍江東方學院 食品與環境工程學部，黑龍江哈爾濱150066；2.內蒙古自治區食品藥品審評查驗中心，內蒙古呼和浩特010011；3.呼倫貝爾雙娃乳業有限公司，內蒙古呼倫貝爾162750）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP），是酪蛋白經過特定的蛋白酶水解、分離純化后得到的含有成簇的磷酸絲氨酸的生物活性肽，其生物活性中心可表示為-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-[1]，這種結構的磷酸肽分子中帶有高濃度的負電荷，對于CPP發揮其生理功能是必不可少的。由于CPP具有這種特殊的核心結構，既能抵抗消化道中各種酶的攻擊免遭水解，又可以與鈣離子結合形成可溶性絡合物，從而有效地防止鈣在小腸pH值呈中性或弱堿性環境下形成磷酸鈣沉淀，從而促進鈣在小腸中吸收[2-4]。除鈣外，CPP還可促進鐵、錳、鋅、硒等礦物質的吸收，因此被譽為“礦物質載體”[5-7]。經過國內外科學家的大量研究表明，CPP也具有防齲齒、促進牙齒、骨骼中鈣的沉積和鈣化、提高繁殖性能、誘導腫瘤細胞凋亡、增強機體免疫力及促進體內益生菌增殖等營養功能[8-11]。

目前，CPP的應用相當廣泛，主要應用于適合兒童、老人、孕婦等不同人群食用的各種保健食品[12]，我國食品安全國家標準GB 14880-2012《食品安全國家標準-食品營養強化劑使用標準》指出CPP可應用于嬰幼兒配方食品、糧食和糧食制品、飲料等，并對使用量作了明確的規定[13]。日本和德國等國早已把CPP作為功能性食品，我國多家企業也將CCP作為食品營養強化劑添加在嬰幼兒奶粉和保健食品中。

近年來，關于食品中CPP含量的測定方法有很多種，但迄今國內尚無權威的、統一的檢測方法。本研究針對國內外CPP檢測技術的研究情況、存在的問題和研究方向分別進行闡述，不僅為食品中CPP含量測定方法的研究提供借鑒，而且對于指導同類產品中CPP含量的檢測具有一定參考價值。

1 酪蛋白磷酸肽檢測方法研究現狀

目前，研究較多的CPP檢測方法主要有氯化鋇-乙醇沉淀法、毛細管區帶電泳法、液相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜法等。這些方法均具有各自的優勢，同時也有著一定的不足。

1.1 氯化鋇-乙醇沉淀法

氯化鋇-乙醇沉淀法是在適當的溫度和pH值條件下，CPP分子間可通過鋇離子（Ba2+）形成橋連，加入一定濃度的乙醇即可使橋連狀的CPP分子團沉淀下來，將得到的CPP沉淀進行分離、干燥，稱重后即可得出產品中CPP含量[14-15]。現行的標準GB 31617-2014《食品安全國家標準食品營養強化劑酪蛋白磷酸肽》[16]中采用此方法對CPP含量進行檢測，準確度差，效果并不理想。

陳雪香等[17]對來自8個不同公司樣品中CPP含量進行測定（樣品純度較低），分別采用氯化鋇-乙醇沉淀法、氮磷比（N/P）法及高效液相色譜法。其中氯化鋇-乙醇沉淀法利用鹽酸調節樣液的pH值至4.6使蛋白質溶解度降低而形成沉淀，5℃4000 r/min離心30 min，取上清液加入氯化鋇溶液使CPP分子形成橋連，再加入乙醇后得到CPP沉淀。經分離、干燥后測定8個樣品中CPP含量，比較8種樣品測定結果得出，樣品中CPP含量最低為19.43%，最高為38.01%，與N/P的結果和實際值相差較大，得出對于CPP純度較低的樣品而言，添加的其它成分導致最后測定結果有較大偏差。

張帥等[18]采用氯化鋇-乙醇沉淀法測定鈣片中CPP含量，參照陳雪香的方法并在此的基礎上加以改進，把離心機參數調整為8000 r/min離心15 min，同時為使CPP沉淀更完全，增加了靜止的時間，測定的5個樣品中CPP回收率均高于220%。該方法操作繁瑣費時，受pH值、沉淀時間及樣品中其它可以和Ba2+離子絡合的組分的影響，導致回收率有較大程度偏高，不適用于添加了各種組分的保健品中CPP含量測定。

1.2 毛細管區帶電泳法

毛細管區帶電泳法（capillary zone electroporesis，CZE）是毛細管電泳中最簡單、也是目前應用相對較多的一種分離方式[19-21]。其分離機理是在緩沖溶液中帶電粒子在電場的作用下以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動形成電泳，電泳的移動和電滲流結合而使分子分離。

Adamson等[22]利用CZE分析了多組分CPP。嘗試將CPP的絕對電滲流與其物理化學性質聯系起來，從蛋白質消化液中選擇性沉淀多個含磷酰基的肽，使用C8（5 μm，4.6 mm×220 mm）反相高效液相色譜分離純化后，樣品經0.1%的三氟乙酸（1 mg/mL）溶解，用CZE對多組分進行分析，通過測定與中性內標的相對遷移時間確定了各種肽段的絕對電滲流，獲得了良好的線性關系（R2=0.993）。

王利民等[23]利用兩種規格石英毛細管，不同的檢測波長、緩沖液及pH值不同的緩沖液，在工作電壓30 kV、柱溫25℃的條件下測定CPP的含量，研究發現在使用50 cm×70 μm i.d.石英毛細管柱，檢測波長設為200 nm，用pH 9.2的四硼酸鈉緩沖液CPP會得到理想的分離效果。該方法操作簡便、分離和測定速度快、分辨率高、重現性好、樣品及緩沖液用量少、自動化程度高。但由于一些食品中的蛋白質和鹽類成分會對測定結果造成干擾，故該法僅適合一些CPP制劑產品的含量測定[24]。

牟光慶等[25]用CZE對CPP進行了分離和測定。在Adamson等[20]人的基礎上略加改動，樣品經0.1%的濃度為50 mg/L三氟乙酸溶解，在工作電壓30 kV、柱溫25℃、毛細管長度50 cm、內徑70 μm、紫外檢測波長200 nm、緩沖液為pH 9.2的硼酸緩沖液條件下測定，得到不同N/P樣品的CPP。結果表明，N/P可以反映出CPP肽鏈的長短和磷酸基的密度，N/P越小，CPP含量越高，但前處理過程復雜，受pH值及溫度影響。

1.3 液相色譜-質譜聯用法

高效液相色譜-質譜聯用法（high performance liq－uid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS）是目前比較成熟的一種聯用技術，它將高效液相色譜可以分離不穩定組分和質譜對被測組分高度的鑒別能力結合起來[26-28]，即使在檢測復雜樣品時，也具有良好的分離效果及較高的靈敏度[29]。

賴奕堅等[30]用HPLC-MS法，以選擇離子模式分別測定CPP標準樣品、空白樣品以及添加1.0%CPP標樣的樣品，根據掃描結果選取了離子質荷比為454.3分離效果較好、不受雜質峰干擾的特征峰作為CPP的代表，用上述方法對4批次CPP樣品進行分析，檢出限為 1 μg/mL，在 1 μg/mL～100 μg/mL 范圍內線性回歸方程為y=3 074.6x+684.6，R2=0.999，回收率在96%～104%之間。該法前處理簡便，專屬性好，靈敏度高，可用于測定鈣強化食品中CPP的含量，但是由于不同廠家的樣品各異，會導致標志峰存在差異，且未對該特征峰作為CPP的代表做進一步的分析。

胡蓓等[31]利用蛋白質數據庫確定酪蛋白氨基酸序列信息，通過高分辨質譜篩選出CPP原料中具有特異性的肽段，再通過多反應離子監測模式對CPP特征肽進行定量測定，依據CPP原料與CPP特征肽含量折算系數，采用同位素稀釋內標法確定出樣品中CPP的含量。該方法在10 mg/100 g～150 mg/100 g范圍內線性關系良好，R2=0.999，回收率在96.2%～100.2%之間。與鋇鹽沉淀法、CZE法比較，具有前處理簡單，分析速度快，靈敏度高，定量結果準確，檢測限低等優點，然而其定量限為1 mg/100 g，僅適用于低含量CPP的檢測，并需要使用較為大型、昂貴的儀器，測試成本較高。

1.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是以液體作為流動相，色譜柱為固定相，待測樣品在流動相的攜帶下進入色譜柱，并基于被測組分在兩相間具有不同的吸附能力來達到分離的目的[32-34]。目前，對于CPP的分離檢測技術，高效液相色譜法應用比較普遍。比如，張帥等[16]還用HPLC法分析了鈣片中CPP的含量，樣品處理后，以三氟乙酸（TFA）水溶液及含有機相為5%～35%的TFA乙腈溶液為流動相梯度淋洗，檢測波長為215 nm，選用C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱和紫外檢測器測定。在此條件下，CPP分離效果良好，檢出限為6.81 μg/mL，回收率為96.75%～104.07%，說明HPLC法準確度和靈敏度較高。

Miquel[35]等利用高效液相色譜儀對CPP中可能影響礦物質利用的磷酸絲氨酸殘基序列鑒定，色譜柱為C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），樣品能得到較好的分離效果，對β-酪蛋白水解產生的CPP能夠準確的定量。Kosalkova[36]等也試圖采用HPLC法對食品中CPP含量的檢測方法進行研究。

田隨安等[37]用HPLC對保健食品中CPP含量進行測定。以乙腈和0.1%冰乙酸溶液作為流動相梯度洗脫，柱溫25℃，色譜柱為Diam onsil C18250mm×4.6mm，由于樣品在240 nm和280 nm下都有紫外吸收，對比發現檢測波長為280 nm時不易受流動相干擾，并在此最佳波長下測定樣品，得到最低檢出限為10 μg/mL，回收率在91%～103%之間，相對標準偏差為3.2%，適用于保健食品中CPP含量的測定。

劉玉娟等[38]把經過溫水溶解的乳粉樣品超聲提取、離心后用高效液相色譜分析。采用ODS（125 mm×4.0 mm）色譜柱分離，并對經常使用的兩種流動相有乙腈-0.1%乙酸水溶液或乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液進行對比，結果表明，以乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動相梯度洗脫時，峰型較好，故選用該流動相，用紫外檢測器對樣品檢測。檢出限為6.25 mg/kg，線性范圍為5.0 μg/mL～100.0 μg/mL，加標回收率為 71.4%～94.2%，方法樣品前處理簡單，檢測結果符合定性定量要求，適合奶粉中CPP含量的檢測。

梁艷等[39]以CPP原料作為標準品，通過測定樣品中CPP的質量分數來確定CPP的含量。樣品經提取、凈化后，采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以一定比例的乙酸-甲醇溶液和乙酸-水溶液進行梯度洗脫，在紫外檢測器波長為280 nm的最佳條件下測定乳制品CPP含量。兩種樣品的相對標準偏差分別為3.68%和1.89%，回收率為96.0%和97.1%，該方法能將樣品中的CPP較好的分離出來，準確度與重現性良好，適用范圍廣。

1.5 其他分析方法

龐廣昌等[40]為找到適合不同層次CPP含量測定的方法，對直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法及聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（isoelectric focusing electrophoresis，IFE）法進行研究，發現這3種方法在不同的情況下，都可以測定CPP含量。直接定磷法前處理簡便，重現性好，適用于產業CPP含量測定，但由于一些含有磷酸的肽也包含在內，會得到一個偏高的結果，故用此方法前必須要測定樣品中的無機磷及非蛋白磷；SDS-PAGE法操作較為復雜，且電泳圖譜中含磷帶與不含磷帶無明顯分界，在切下含磷帶時往往會混入其它肽，導致CPP含量較高，僅適用于CPP組分測定，但不需測定樣品中的無機磷及非蛋白磷；IFE法測定CPP含量，準確度高、重現性及穩定性好，適用于較精確的測定，但需要昂貴的實驗設備及藥品。

2 酪蛋白磷酸肽檢測面臨的困難與發展方向

2.1 食品成分復雜

食品的種類多樣，其組成基質復雜，除碳水化合物、脂肪、蛋白質等主要營養物質外，大多數添加CPP的產品中還含有鹽類、無機磷及少量非蛋白質含磷物等多種化學物質，對檢測過程中樣品（尤其是鈣強化食品）的準確定量造成了一定程度上的干擾。

2.2 檢測技術的局限性

雖然CPP含量的檢測方法有很多種，但由于CPP產品成分復雜，有些方法在應用到食品中CPP的測定存在一定的局限性。氯化鋇-乙醇沉淀法中一些非CPP的組分也可以和Ba2+結合形成絡合物，專屬性差，使測定值高于實際值，只能用于單一CPP產品含量測定；CZE法在適當的條件下可以得到很好的分離效果且有良好的重現性，但受蛋白質和鹽類物質干擾較大；CPP經酶水解制得，無固定分子量，HPLC-MS法對CPP含量的監測存在一定難度。

2.3 CPP檢測技術發展方向

相對于高效液相色譜-質譜聯用法、毛細管區帶電泳法、氯化鋇-乙醇沉淀法等檢測技術，HPLC法克服了食品成分復雜的局限性，具有前處理簡單、快速、專屬性好、靈敏度高等優點，但在實際應用中仍然有較多問題。就添加了CPP的嬰幼兒配方奶粉而言，測定過程中無市售標準品，需要以CPP原料為對照品對CPP含量進行測定，由于樣品生產廠家有所不同的，會導致不同樣品的標志峰及其含量會存在差異。雖然使用HPLC法檢測部分產品CPP含量受到標準品的限制，但鑒于CPP的定性定量檢測都優于以上方法，可以作為未來CPP檢測研究方向。

3 結論

CPP在食品工業的應用中具有廣闊的前景，作為迄今為止發現的唯一具有促進鈣吸收作用的活性肽，多用于嬰幼兒配方食品、乳制品、保健品等食品中。目前，CPP在我國還屬于新興行業，生產CPP原料的企業很少且尚未達到規模，檢測技術的研究也存在一定程度上的難度，從而使CPP在食品工業中的應用受到了限制。但隨著人們生活水平日益提高，在食品中添加一定量的CPP越來越會受到消費者的重視，并將成為一種趨勢，故研究CPP的定量檢測技術在保證食品安全方面具有十分重要的意義。雖然目前國內外CPP含量的檢測方法有很多種，但大多存在操作復雜、分析時間長、準確度不高及設備昂貴等問題。而HPLC法作為一種現代儀器分析手段有方便、快捷、準確度和靈敏度高等其他方法無法比擬的優點，在食品中CPP的定量測定中運用日趨廣泛并得到了一些學者的認可，可以較好的滿足CPP含量的測定需要，所以只要對阻礙HPLC法發展的適于不同食品測定的CPP標準品加以開發利用，則可作為未來研究開發食品中統一的CPP檢測方法國家標準的發展方向。