響應面優化制備馬面魚皮膠原蛋白的預處理工藝研究

公維潔，卓先勤，杭瑜瑜，王卉，黃寶芬

（海南熱帶海洋學院，海南三亞572022）

我國魚類資源十分豐富，種類繁多，但是快速發展的魚類加工業給我們帶來了大量的廢棄物（魚鱗、魚皮、魚骨、魚內臟、魚頭等）。目前，我國水產加工和綜合利用與發達國家相比存在較大差距，其水產品加工率為30%，低于發達國家的80%[1]。加工過程中的廢棄物，大部分用于生產飼料魚粉，有價值的成分利用率較低。研究發現，這些廢棄物中含有豐富的膠原蛋白，尤其是魚皮含量顯著，可高達80%[2]。因此，魚皮膠原蛋白的研究受到廣大科學工作者的關注[3-7]。

魚皮中除了含有豐富的膠原蛋白，還含有脂肪（約1.5%）、雜蛋白（約2%）及色素等雜質。這些雜質不僅會影響魚皮中膠原蛋白的提取率，還會影響產品的感官品質和純度，因此在提取之前需要對原材料進行脫脂除雜蛋白的預處理，預處理的效果會成為膠原蛋白提取的關鍵[8]。傳統的脫脂方法有：蒸煮法[9]、堿法、有機溶劑萃取法[8]、酶法[10]、乳化法[11]；除雜蛋白的方法有：鹽溶液浸泡法、堿法[12]。

馬面魚（Navodon septentrionalis）是我國排名第二位的海洋經濟魚類。在馬面魚加工過程中，魚皮會整張丟棄，造成巨大的資源浪費。本研究以馬面魚皮為原料，探索如何去除馬面魚皮中的脂肪和雜蛋白，同時減少膠原蛋白的損失，以期得到高品質的馬面魚皮膠原蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚：市售。

L-羥脯氨酸、牛血清蛋白（生化試劑標準品）、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、液溴（分析純）：山東西亞股份有限公司；正丁醇、異丙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

721G-可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SE602F-電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限股份公司；HH-數顯恒溫水浴鍋：金壇市盛藍儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬面魚皮預處理

將新鮮的馬面魚皮洗凈，凍干，剪切成1 cm2碎片，于-20℃保存備用，使用時于4℃條件下解凍。

1.3.2 脫脂工藝優化

1.3.2.1 脫脂劑篩選

準確稱取3 g的干燥馬面魚皮6份，分別加入正丁醇、異丙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯150 mL進行脫脂處理，于4℃浸泡20 h，分離并揮干魚皮中的溶劑，測定其脂肪含量，比較脫脂率，篩選出最佳脫脂劑。

1.3.2.2 脫脂單因素試驗

1）脫脂劑濃度

在固定料液比為1∶50（g/mL），脫脂溫度為4℃、脫脂時間20 h的條件下，用異丙醇溶液進行魚皮脫脂，分別調節異丙醇濃度為5%、10%、15%、20%、25%浸泡魚皮。測定其脂肪含量，并計算脫脂率。

2）脫脂時間

在固定料液比為1∶50（g/mL）、脫脂溫度為4℃、異丙醇濃度為10%的條件下，進行魚皮脫脂，分別浸泡魚皮 6、12、18、24、30 h，進行脫脂處理。測定其脂肪含量，并計算脫脂率。

3）脫脂溫度

在料液比為 1 ∶50（g/mL）、脫脂時間 20 h、試劑濃度為10%的條件下，進行魚皮脫脂，分別調節脫脂溫度為 20、25、30、35、40、45 ℃。測定其脂肪含量，并計算脫脂率。

4）料液比

在脫脂時間為20 h、脫脂溫度為4℃、試劑濃度為10%的條件下，進行魚皮脫脂，分別調節料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）。測定其脂肪含量，并計算脫脂率。

1.3.2.3 脫脂響應面優化設計

經過單因素試驗的綜合分析后，根據Box-Behnken的試驗設計原則，以異丙醇濃度、脫脂時間、料液比為考察因素，馬面魚皮脫脂率為響應值，優化試驗。試驗因素與水平表見表1。

表1 脫脂響應面因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface on degreasing

1.3.2.4 脫脂率的計算

樣品中脂肪含量采用索氏抽提法測定。

脫脂率/%=（1-脫脂后魚皮中脂肪含量/魚皮原料中脂肪含量）×100

1.3.3 除雜蛋白工藝優化

1.3.3.1 除雜蛋白試劑篩選

采用福林酚法[13]測馬面魚皮中雜蛋白的溶出量，根據Gabor Huszar的羥脯氨酸法[14]得到膠原蛋白的流失率。準確稱取7份1 g的干燥馬面魚皮，分別用0.5mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl與 NaOH聯用，NaCl與NaHCO3聯用，NaCl與Na2CO3聯用進行除雜蛋白處理，料液比為1∶50（g/mL），于4℃浸泡20 h。測定雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

1.3.3.2 除雜蛋白的單因素試驗

1）試劑濃度對馬面魚皮除雜蛋白效果的影響

在固定料液比為1∶50（g/mL）、浸泡溫度為4℃、時間20 h的條件下，分別配制均為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯用溶液進行除雜蛋白處理，吸取除雜上清液，測定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

2）浸泡時間對馬面魚皮除雜蛋白效果的影響

在固定料液比為1∶50（g/mL）浸泡溫度為4℃的條件下，用NaCl與NaOH聯用進行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別浸泡魚皮 5、10、15 、20、25 h 和 30 h 后，吸取除雜上清液，測定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

3）料液比對馬面魚皮除雜蛋白的效果的影響

在固定浸泡溫度為4℃、時間20 h的條件下，用NaCl與NaOH聯用溶液進行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別調節料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）和1∶25（g/mL），吸取除雜上清液，測定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

1.3.3.3 除雜蛋白響應面優化設計

經過單因素試驗的綜合分析后，根據Box-Behnken的試驗設計原則，以NaCl與NaOH聯用濃度、浸泡時間、料液比為考察因素，馬面魚皮雜蛋白的除雜率為響應值，優化試驗。試驗因素與水平表見表2。

表2 除雜蛋白響應面因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface on removing impurity proteins

1.3.3.4 計算公式

魚皮中雜蛋白的溶出率，按照該公式進行計算：

式中：Y表示魚皮雜蛋白的溶出率，%；c表示上清液蛋白質的濃度，μg/mL；V表示上清液蛋白質的體積，mL；W表示濕魚皮的質量，g。

1.4 數據處理方法

試驗數據采用excel和origin9.1軟件分析繪圖，采用統計分析軟件DesignExpert8.0.6.1進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 脫脂工藝優化

2.1.1 脫脂劑篩選

分別采用異丙醇、正己烷、乙醚、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯進行脫脂處理，比較不同試劑的脫脂效果見圖1。

圖1 不同試劑的脫脂效果Fig.1 Effect of degreasing agent type on degreasing efficiency

由圖1所示，在同等條件下，異丙醇的脫脂率最高，為53.04%；其他依次是乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、正己烷、石油醚，脂肪脫脂率分別為47.16%、43.80%、41.20%、37.58%、28.32%。此外，異丙醇較其它試劑更具安全性，故本試驗選用異丙醇為最優脫脂劑。

2.1.2 脫脂單因素試驗

2.1.2.1 脫脂劑濃度的影響

保持其他條件不變，分別用5%、10%、15%、20%、25%的異丙醇溶液進行脫脂處理，脫脂結果見圖2。

圖2 脫脂劑濃度對脫脂率的影響Fig.2 Effect of reagent concentration on degreasing efficiency

如圖2所示，脫脂劑濃度對脫脂率的影響較大，隨著濃度的提高，脫脂率先升高后降低。異丙醇濃度為15%時，脫脂率達到最高。故選擇異丙醇濃度5%～15%作為適宜的脫脂濃度范圍。

2.1.2.2 脫脂時間的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別脫脂6、12、18、24、30 h，脫脂結果見圖 3。

圖3 脫脂時間對脫脂率的影響Fig.3 Effect of treatment time on degreasing efficiency

如圖3所示，隨著脫脂時間的延長，馬面魚皮的脫脂率不斷提高，當脫脂時間達到24 h后，脫脂率變化緩慢，可能是因為隨著脂肪不斷溶出，溶劑達到飽和，導致脂肪不再溶出。故選擇18 h～30 h作為最佳的范圍脫脂時間。

2.1.2.3 脫脂溫度的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別在20、25、30、35、40、45 ℃進行脫脂處理，脫脂結果見圖 4。

圖4 不同脫脂溫度的脫脂效果Fig.4 Effect of temperature on degreasing efficiency

如圖4所示，隨著溫度的升高，馬面魚皮脫脂率逐漸升高，40℃后脫脂率略有降低，考慮到高溫易使膠原蛋白變性，并提高生產成本，故選擇40℃作為最佳的脫脂溫度。

2.1.2.4 料液比的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別在料液比為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 （g/mL） 進行脫脂，脫脂結果見圖5。

圖5 不同料液比的脫脂效果Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on degreasing efficiency

如圖5所示，當料液比為1∶15（g/mL）時，脂肪脫脂率最高，達到78.66%，當料液比超過1∶15（g/mL）時，脫脂率顯著下降。由此可見，適當的料液比可以促進脂肪溶出，過高的料液比反而導致脫脂效果下降，故選擇料液比 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）作為最佳的范圍。

2.1.3 脫脂的響應面結果與分析

2.1.3.1 脫脂的響應面試驗設計及數值分析

對馬面魚皮脫脂工藝進行響應面優化，結果見表3。利用Desigin-Expert.V8.0.6.1軟件對表3進行了擬合分析，得到了回歸方程方差分析表4，并得到了脫脂響應面回歸模型方程為：脫脂率（Y）=+93.91+1.51A+2.71B2.94C-1.89AB-0.23AC+2.83BC-2.91A2-5.16B2-5.42C2。由表4可知，該模型的P＜0.000 1，表明響應面回歸模型達到極顯著水平，且相關系數：R2=0.977 5，表明試驗誤差較小，各因素之間線性關系顯著，可以用于馬面魚皮的脫脂工藝試驗的預測。

表3 脫脂的響應面設計及結果Table 3 The design and results of box-behnken on degreasing

表4 脫脂的回歸方程各項方差分析Table 4 Analysis of variance for regression coefficient on degreasing

方程中一次項B、C對脫脂率的影響極顯著，A對其影響顯著。交互項BC對脫脂率的影響極顯著，AB對其影響顯著，AC對其影響不顯著。二次項A2、B2、C2對脫脂率的影響均為極顯著。故各單因素對馬面魚皮的脫脂影響不是簡單的線性關系。由表中F值可知，影響脫脂率的因素的主次順序為：料液比>脫脂時間>異丙醇濃度。

2.1.3.2 脫脂響應面圖分析

響應面圖形能較直觀地反映出各因素對響應值的影響，響應面坡度越陡，表明該因素對響應值影響越顯著，等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱。各因素間相互作用對脫脂魚皮脫脂率的影響見圖6。

圖6 各因素相互作用對馬面魚皮脫脂率的影響Fig.6 Interaction effect on degreasing efficiency

由圖6可以看出，馬面魚皮的脫脂條件中，料液比對脫脂效果的影響最為顯著，表現的曲面相對其他的要陡，脫脂時間次之，且料液比與脫脂時間的交互作用最為顯著，表現的等高線圖最為橢圓形，而脫脂時間與異丙醇濃度的作用效果最小，等高線圖為圓形，這與模型方差的分析結果相一致。

2.1.3.3 脫脂工藝優化后參數驗證

優化分析，得到脫脂最優工藝為：異丙醇濃度為15%，時間為 24.96 h，料液比為 1 ∶16.46（g/mL），理論值為92.9%。考慮到試驗操作可行性，將最佳脫脂條件改為：異丙醇濃度15%、脫脂時間25 h、料液比為1∶15（g/mL），在此條件下進行3次重復試驗，實際測得的脫脂率分別為：93.14%、92.78%和93.37%，平均脫脂率值為93.10%，與理論值的相對誤差為0.2%。說明采用響應面法優化馬面魚皮的脫脂工藝準確可靠，具有實際可操作性。

2.2 除雜蛋白工藝優化

2.2.1 除雜蛋白試劑篩選

分別用 0.5 mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl與 NaOH 聯用，NaCl與 NaHCO3聯用，NaCl與Na2CO3聯用進行除雜蛋白處理，比較不同試劑的除雜效果見圖7。

如圖7所示，在同等條件下，0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯用除雜蛋白的效果最佳，除雜率達到41.54%，同時膠原蛋白的流失率最低，為0.3%，故選擇NaCl與NaOH聯用為最佳的除雜蛋白試劑。

圖7 不同試劑的除雜蛋白效果Fig.7 Effect of degreasing agent type on impurity proteins removal rate

2.2.2 除雜蛋白單因素分析

2.2.2.1 試劑濃度的影響

保持其他條件不變，分別配制均為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯用溶液進行除雜蛋白處理，除雜及膠原蛋白流失結果見圖8。

圖8 不同試劑濃度的除雜蛋白效果Fig.8 Effect of reagent concentration on impurity proteins removal rate

由圖8可知，當NaCl與NaOH聯用溶液的濃度均為0.3 mol/L時雜蛋白除雜效果最好，為25.13%，膠原蛋白流失效果相對較低，故選NaCl與NaOH聯用溶液濃度均為0.2 mol/L～0.4 mol/L作為最佳的范圍濃度。

2.2.2.2 浸泡時間

保持其他條件不變，用NaCl與NaOH聯用進行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別浸泡魚皮 5、10、15 、20、25、30 h后，除雜及膠原蛋白流失結果見圖9。

圖9 不同浸泡時間的除雜蛋白效果Fig.9 Effect of treatment time on impurity proteins removal rate

由圖9可知，浸泡時間對膠原蛋白的流失影響較小，當NaCl與NaOH聯用浸泡時間為25 h時除雜蛋白效果最好，故選擇的最佳的范圍除雜時間為20 h～30 h。

2.2.2.3 料液比

保持其他條件不變，用NaCl與NaOH聯用進行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別調節料液比為1∶5、1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），除雜及膠原蛋白流失結果見圖10。

圖10 不同液料比的除雜蛋白效果Fig.10 Effect of solid-to-liquid ratio on impurity proteins removal rate

由圖10可知，隨著液料比的增加，雜蛋白除雜率逐漸增加，膠原蛋白流失率逐漸遞減，當液料比增加到20（g/mL）之后，雜蛋白除雜率增加趨勢緩慢，膠原蛋白流失率遞減的趨勢也趨于平緩，故選擇液料比15（mL/g）～ 25（mL/g）作為最佳范圍。

2.2.3 除雜蛋白的響應面分析

2.2.3.1 除雜蛋白響應面試驗設計及數值分析

對馬面魚皮除雜蛋白工藝進行響應面優化，結果見表5。

表5 除雜蛋白響應面結果Table 5 The design and results of Box-Behnken on removing impurity proteins

根據表5數據進行了擬合分析，得到了回歸方程：雜蛋白除雜率（Y）=30.59+2.36A-0.69B+3.01C-1.36AB-1.30AC+1.50BC-7.80A2-2.24B2-4.40C2。

對回歸模型的顯著性分析見表6，該模型的P＜0.000 1，表明響應面回歸模型達到極顯著水平，且相關系數：R2=0.992 0，表明試驗誤差較小，各因素之間線性關系顯著，可以用于馬面魚皮的除雜蛋白工藝試驗的預測。

表6 除雜蛋白的回歸方程各項方差分析Table 6 Analysis of variance for regression coefficient on removing impurity proteins

方程中一次項A、C對除雜率的影響均極顯著，B對除雜率的影響顯著。交互項BC對除雜率的影響極顯著，AB、AC 對其影響顯著。二次項 A2、B2、C2對除雜率的影響均極顯著。故各單因素對馬面魚皮的除雜蛋白影響不是簡單的線性關系。由表中F值可知，影響除雜率的因素的主次順序為：料液比>NaCl與NaOH聯用濃度>浸泡時間。

2.2.3.2 除雜蛋白響應面圖分析

根據回歸方程，得到各因素間交互作用對雜蛋白提取率的影響，見圖11。

如圖11所示，馬面魚皮除雜蛋白的條件中，液料比對除雜蛋白的效果的影響最為顯著，表現的曲面相對其他的要陡，NaCl與NaOH聯用濃度次之，浸泡時間影響最小。由等高線圖c可以看出，浸泡時間與液料比的交互作用對脫脂率的影響最為顯著。

2.2.3.3 除雜蛋白工藝優化后參數驗證

根據軟件分析，得到除雜蛋白最優工藝為：NaCl與NaOH聯用濃度為0.31 mol/L，時間為24.55 h，料液比為1∶22（g/mL），理論值為31.24%。根據實際情況，調整為NaCl與NaOH聯用濃度為0.3 mol/L，時間為25 h，料液比為 1 ∶20（g/mL），在此條件下進行 3 次重復試驗，實際測得的除雜率為31.09%，與理論值基本吻合。說明采用響應面法優化馬面魚皮的除雜蛋白工藝準確可靠，具有實際可操作性。

圖11 各因素相互作用對馬面魚皮脫脂率的影響Fig.11 Interaction effect on impurity proteins removal rate

3 結論

以馬面魚皮為原料，分別對魚皮中的脂肪和雜蛋白的脫除工藝進行了研究。利用溶劑萃取法脫脂，且采用索氏抽提法測定馬面魚皮中的脂肪含量；利用福林酚法測定馬面魚皮中的雜蛋白含量。通過單因素試驗和響應面優化得到馬面魚皮脫脂最佳條件為：采用異丙醇溶液為脫脂試劑，濃度15%，料液比為1∶15（g/mL），在 40℃時處理 25 h，脂率值達到93.10%；除雜蛋白最佳條件為：采用NaCl與NaOH聯用溶液進行魚皮除雜蛋白處理，濃度均為0.3 mol/L，料液比1∶20（g/mL），處理25 h，不僅能大大的除去雜蛋白，還能降低膠原蛋白的流失率，平均除雜率為31.09%。本試驗對脫脂條件優化后，脫脂率較夏姍姍等[15]試驗的脫脂率有所提高，為馬面魚皮的深加工提供理論依據。

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