植物乳桿菌KF5胞外多糖合成條件的優化研究

梁增瀾，李慧，張睿，白小佳，王艷萍，李超，*

（1.天津科技大學新農村發展研究院，天津300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）是一類能發酵 碳水化合物而產生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱，廣泛存在于動、植物體及發酵食品中。由于LAB被普遍認為是安全的（Generally Recognized as Safe，GRAS），在發酵過程中能夠賦予食品以特殊的風味、口感以及功能性營養成分（如有機酸、胞外多糖等），因而由LAB發酵的食品普遍受到消費者的歡迎和喜愛[1]。其中，部分LAB能夠在生長代謝過程中分泌黏液或莢膜多糖，被稱為LAB胞外多糖（exopolysac－charides，EPS）[2]。LAB EPS 不僅能夠賦予發酵乳制品良好的風味和口感，還能夠有效改善產品的性能，如增強持水力、降低乳清析出率、增加黏度等[3]。此外，國內外相關研究表明LAB EPS具有多種生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、調節腸道菌群、降低血清膽固醇、免疫調節等多種生物學功能[4]，是新型食品級多糖的一種良好來源，可被廣泛運用于食品工業化生產、化妝品和微生物制藥等領域中。

自上世紀40年代成功開發出由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteioides）發酵生成的右旋糖酐作為代血漿的主要成分以來，微生物胞外多糖引起了國內外學者的廣泛關注[5]。然而，LAB EPS的產量普遍偏低，這不僅與菌株特異性有關，還受諸多因素的影響，如培養基組分、培養條件等，因而限制了其工業化生產[6]。研究選取從我國西藏傳統乳制品發酵劑——藏靈菇（Kefir粒）中分離得到的一株植物乳桿菌KF5（Lactobacillus plantarum KF5），對其進行EPS合成條件的優化，并對影響因素進行了分析。本研究旨在開發具有合成EPS特性的自主知識產權LAB菌株，為工業化生產EPS提供一定的理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清粉：內蒙古伊利集團股份有限公司；乳糖（AR）：上海試劑二廠；胰蛋白胨（AR）：北京奧博星生物技術責任有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、CH3COONa·3H2O、Tween-80等生化試劑：天津市化學試劑三廠。

植物乳桿菌 KF5（Lactobacillus plantarum KF5）：分離自我國西藏傳統乳制品發酵劑—藏靈菇（Kefir粒），保藏于保藏于發酵食品與微生物資源開發研究室。

1.2 儀器與設備

DY-2型厭氧培養箱：浙江義烏冷凍機總廠；JA2003型光電分析天平：上海精科天平廠；高壓干燥滅菌鍋：日本YAMATO公司；YXQGO2型蒸汽滅菌鍋：山東新華醫療器械股份有限公司；紫外可見分光光度計UV-9100：北京瑞利分析儀器公司；Avanti J-E型柜式冷凍離心機：美國BECKMAN。

1.3 培養基

乳清培養基：乳清100 mL（取40 g乳清粉溶解于1 L蒸餾水中，調節pH值至5.5，沸水浴30 min，冷卻，4℃ 8000 g離心 15 min，調節 pH值至6.4，沸水浴30 min，冷卻，4℃ 8 000 g離心 15 min，取上清液，即為乳清液），乳糖1.0 g，胰蛋白胨0.5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，CH3COONa·3H2O 5.0 g，Tween-80 0.1 mL，礦物質溶液 1.0 mL（0.4 g/L MgSO4·7H2O，0.15 g/L MnSO4·4H2O，0.18 g/L FeSO4·7H2O，0.1 g/L NaCl），pH 6.2，115 ℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將保藏于-80℃甘油管中的L.plantarum KF5，于乳清液體培養基中連續活化兩代，直至菌株活力恢復。

1.4.2 生長曲線的測定

將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于400 mL乳清培養基中，30℃靜置厭氧培養（80%N2，10%H2，10%CO2）。以 2 h 為等時間段，將發酵液搖勻，取菌液于650 nm處測定吸光度。以時間為橫坐標，OD650為縱坐標，繪制生長曲線。

1.4.3 培養過程中EPS合成量及pH值的測定

將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于400 mL乳清培養基中，30℃靜置厭氧培養，以4 h為等時間段，將發酵液搖勻，取一定體積的發酵液測定pH值。然后將發酵液100℃水浴30 min，4℃、10 000 g離心15 min除去菌體，取一定體積的上清液裝入透析袋，4℃蒸餾水透析（截流量6000 Da～8 000 Da），直至蒸餾水中無單糖檢出。以苯酚-硫酸法[7]測定透析袋內EPS含量，確定培養過程中EPS合成量及pH值隨培養時間的變化情況，并確定培養時間。

1.4.4 培養方式對EPS合成的影響

在確定了培養時間對EPS合成影響的條件下，將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于100 mL乳清培養基中，分別進行30℃和37℃靜置厭氧培養，37℃靜置有氧培養，確定不同培養條件對EPS合成的影響。發酵液處理同1.4.3。

1.4.5 接種量對EPS合成的影響

在確定培養時間、培養方式對EPS合成影響的基礎之上，分別將L.plantarum KF5種子液以2%、3%、4%、5%的比例接種于100 mL乳清培養基中發酵培養，確定接種量對EPS合成的影響。發酵液處理同1.4.3。

1.4.6 培養基初始pH值對EPS合成的影響

在確定培養時間、培養條件、接種量對EPS合成影響的基礎之上，將乳清培養基的初始pH值調整為5.5、6.0、6.5、7.0。將活化后的 L.plantarum KF5 以一定的比例接種于100 mL不同初始pH值的乳清培養基中進行發酵培養，確定培養基初始pH值對EPS合成的影響。發酵液處理同發酵液處理同1.4.3。

1.4.7 優化試驗條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎之上為進一步優化試驗，分別選取培養時間、培養基初始pH值、接種量為因素，以EPS產量為指標進行L9（34）的正交試驗。利用SAS軟件對正交試驗結果進行數據分析，得出對EPS產量影響的顯著因素，從而獲得優化EPS產量的最佳條件，試驗因素水平如表1所示。

表1 培養時間、培養基初始pH值以及接種量對EPS合成的影響因素水平表Table 1 Factor levels of incubation time，original pH of medium and seed volume

2 結果與分析

2.1 L.plantarum KF5生長曲線的測定

微生物的代謝過程因種而異，不僅受培養基成分及培養條件的影響，也與種齡、接種量有直接關系[8-9]。L.plantarum KF5以2%的接種量接種于乳清培養基后，其生長曲線如圖1所示。

圖1 菌株KF5生長曲線Fig.1 The growth curve of strain L.plantarum KF5

由圖1可知，L.plantarum KF5在0～6 h期間處于延遲期，菌體細胞數目及菌液渾濁度在這期間變化不大，其生理狀態經過適應后逐漸恢復，并開始生長。從第6小時到第24小時為對數生長期，菌體細胞在此期間代謝活躍，菌體數目呈幾何級數遞增，并且細菌數目和原生質總量的增加，這與菌液混濁度增加呈正相關。24 h后則進入穩定生長期，新繁殖細胞數目與死亡的細胞數目在此期間基本處于動態平衡的狀態。

2.2 培養時間對EPS合成的影響

LAB EPS的合成量一般在菌株到達穩定期時最高，穩定末期合成量不再增加，衰亡期時EPS合成量則有所下降[10-12]。因此，通過控制培養時間可以在降低成本的同時提高EPS合成量。培養時間對L.plantarum KF5 EPS合成量及發酵液pH值的影響，結果如圖2所示。

圖2 EPS產量及培養基pH值隨時間的變化Fig.2 Effect of incubation time on EPS production and pH

如圖2所示，培養基的初始pH值為6.2，隨菌株不斷生長，其代謝產物—乳酸也不斷積累，導致發酵液pH值的不斷下降。在培養時間達到24 h即菌體進入穩定期后，細胞數目基本維持動態平衡，因而發酵液的pH值基本保持穩定，達到3.9。菌體處于穩定期后，EPS開始逐漸積累，EPS合成峰期出現在菌體穩定期之后即22 h之后，這與相關文獻報道一致[13-14]。28 h時EPS產量達到最大（75.57 mg/L），但與32 h相差不大（74.64 mg/L）。在發酵后期（32 h后）EPS合成量逐漸下降，這是由于發酵液pH值的降低，菌株進入衰亡期。同時，培養基中的碳源不足以滿足菌株的生長代謝，并且可能在菌株生長代謝過程中存在的糖基水解酶活力增高，導致EPS被降解[15]。LAB EPS在培養過程中的高降解率已成為其運用于工業發酵生產的重要瓶頸，因而可以通過優化培養和提取條件或者采用流加培養的方式改善EPS產量過低的難題[16]。

2.3 培養方式對EPS合成的影響

在發酵過程中，EPS作為乳酸菌的次級代謝產物，伴隨其生長代謝而產生。因此，發酵過程中外界環境會影響乳酸菌的生長情況，進而影響EPS的積累[17-18]。在30℃靜置厭氧，37℃靜置厭氧和37℃靜置有氧的培養方式對EPS合成量的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同培養方式對EPS合成的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖3顯示，3種培養方式對EPS合成的影響無明顯差異（p>0.05）。在37℃厭氧條件下，EPS的合成量達到最大。這可能由于在此培養方式下，菌體生長以及細胞壁大分子的合成都減少，從而使EPS輸出所必需的脂類異戊二烯載體數量增加，可用于EPS的合成[19-20]。然而，從考慮成本的角度出發，37℃有氧培養的方式更適于工業化的應用。因此，后續試驗均采用37℃有氧培養。

2.4 接種量對EPS合成的影響

適當的接種量不但能夠節省發酵時間和成本，有效提高發酵液中最初的活菌數，而且有助于縮短菌體生長的延滯期，提高EPS的合成量[21]。不同接種量（2%～5%）對L.plantarum KF5的EPS合成量影響，結果如圖4所示。

圖4 不同接種量對EPS合成的影響Fig.4 Effect of inoculated amount on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖4所示，L.plantarum KF5在37℃靜置有氧條件下，EPS的合成量隨接種量的升高而增大，采用4%接種量時所合成EPS的量達到最大，為58.79 mg/L。繼續增大接種量至5%時，L.plantarum KF5所合成的EPS量反而降低。這可能由于接種量過高，營養物質主要用于菌體生長，而EPS的積累受到限制，導致EPS合成量下降[22]。因此，從工業化生產成本考慮，后續試驗采用4%接種量。

2.5 培養基初始pH值對EPS合成的影響

pH值是影響EPS合成量的關鍵因素之一，菌體在生長過程中多糖合成的pH值取決于糖基水解酶的最適pH值。菌體合成多糖的最適pH值在5.0～7.0之間[23]。培養基pH值對細菌產胞外多糖的影響歸因于異戊二烯脂的運載活性，pH值的降低將使多糖的合成因失去脂中間體而受阻[17]，且菌體生長過程中會產生乳酸及酶類，隨著這些物質的積累，不僅會造成的培養基pH值降低而不利于菌體生長，而且分泌的酶類對胞外多糖有降解的作用。此外，pH值過高會抑制乳酸菌生長，也不利于胞外多糖累積[24]。因此，可以通過控制培養基pH值以達到提高EPS合成量的目的。培養基初始pH值對L.plantarum KF5合成EPS的影響如圖5所示。

圖5 培養基不同初始pH值對EPS合成的影響Fig.5 Effect of different initial pH on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖5所示，pH值為6.0時EPS的產量達到最大，為71.79 mg/L。這可能是由于其他初始pH值不適宜菌體合成EPS，并且使EPS的合成因子脂中間體減少[17]，造成EPS的合成量降低。

2.6 L.plantarum KF5合成EPS的正交條件優化

2.6.1 正交試驗結果

為確定L.plantarum KF5合成EPS的最適培養條件，在單因素試驗的基礎上，進一步通過正交試驗優化培養條件。分別選取培養時間為因素A，培養基初始pH值為因素B，接種量為因素C，誤差項為因素D；每個因素各取3個水平，以EPS產量為評價指標，進行L9（34）的正交試驗，結果如表2所示。

表2 正交試驗表及結果Table 2 Table of orthogonal experimental designs and results

2.6.2 方差結果分析

方差分析見表3。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

由正交試驗結果可知：最優組合為A2B1C1，即培養時間 30 h，初始 pH 6.3，接種量 3%。RA＞RB＞RC，說明影響EPS產量的因素順序為：培養時間＞培養基初始pH值＞接種量，并且初始pH值和接種量對EPS的合成影響不顯著（p＞0.05），培養時間影響顯著（p＜0.05）。在最優組合A2B1C1的條件下，進行驗證試驗，其EPS合成量達到95.58 mg/L，比正交優化前提高了26.48%。

3 結論

探討不同培養條件，包括培養方式、培養時間、培養基初始pH值及接種量對L.plantarum KF5合成EPS的影響，并在單因素試驗的基礎之上對培養時間、培養基初始pH值及接種量進行了L9（34）正交試驗。試驗結果表明在37℃有氧培養情況下，最佳培養條件為：培養時間30 h，初始pH 6.3，接種量3%。初始pH值和接種量對EPS的合成影響不顯著，培養時間影響顯著（p＜0.05）。在此條件下，L.plantarum KF5的EPS合成量達到95.58 mg/L，比正交優化前提高26.48%。