多位點序列分型技術在熱帶念珠菌中的應用研究

王影 項明潔 劉錦燕 葉書來 周馨

(1.中國科技大學附屬第一醫院檢驗科，合肥 230001；2.上海交通大學附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；3.上海交通大學附屬瑞金醫院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

念珠菌是一類條件致病性真菌，是目前臨床上真菌感染的主要致病菌，常見的有白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌等[1-2]。近年來，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的使用，使得念珠菌的感染率日漸上升[3]。雖然在臨床念珠菌的感染中白念珠菌最常見，但是由非白念珠菌類菌株引起的感染，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，其中以熱帶念珠菌較常見[4]。國內的一些研究顯示，熱帶念珠菌分離率已成為非白念珠菌中第二位或者第三位[5-7]。

分子生物學技術已廣泛應用于鑒定念珠菌基因型別以及菌株間致病相關性的研究，其中，基因分型是一種重要的微生物流行病學研究工具[8-9]，而MLST分型技術是目前公認的最有權威的分型方法。Arianna等[10]已在2005年建立了熱帶念珠菌MLST分型數據庫 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)。熱帶念珠菌MLST分型是基于對其6對管家基因的單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphisms，SNPs)的分析，這6對管家基因分別是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a。通過基因PCR擴散、測序得到臨床菌株各管家基因的序列，與數據庫比對得到每個管家基因的等位基因號，再根據6個管家基因的基因號的組合得到每個菌株的二倍體序列型DST。目前，國內對熱帶念珠菌MLST型別的研究較少，此次研究旨在探究本地區臨床菌株的優勢MLST型別。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株來源 本研究所用的的92株臨床熱帶念珠菌均來自于上海市瑞金醫院自2012～2015年的住院及門急診的71名患者 (53名男性，18名女性)。其中，41株臨床菌株來自于無菌體液 (中段尿30株、血液4株、膽汁2株、引流液2株、導管2株、穿刺液1株)，其余標本來自痰液33株、咽拭子4株、糞便7株、膿液1株、創面2株、肛周3株、分泌物1株。

儀器與試劑 API微生物鑒定系統 (法國梅里埃公司)；PCR儀 (S100TMThermal Cycler PCR，Bio-Rad美國)；Tanon EPS-300水平式電泳儀和Tanon凝膠成像系統 (上海天能科技有限公司)；YPD培養基 (上海博微生物科技有限公司)；Ex Taq酶 (TaKaRa公司)；DNA Marker DL2000 (TaKaRa公司)；MLST引物由生工生物工程 (上海)有限公司進行合成。

1.2 方法

菌株鑒定 將于-80℃ 25%甘油凍存的菌株標本接種于科瑪嘉酵母菌顯色平板，于35℃培養24～48 h后，熱帶念珠菌呈深藍綠色。再用API 20C AUX酵母菌鑒定系統對臨床分離的菌株進行進一步鑒定。將最終鑒定成功的菌落取單克隆增菌培養后，置于-80℃ 25%甘油培養液中凍存待用。

藥敏鑒定 以白念珠菌ATCC 90028為陰性對照，克柔念珠菌ATCC 6258為陽性對照，采用微量肉湯稀釋法檢測菌株的最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。具體檢測方法按照美國臨床實驗室標準化協會 (the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案進行。

DNA提取 熱帶念珠菌經YPD培養基35℃培養過夜，收集菌體，加酵母菌裂解液 (10%SDS、0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA和蛋白酶K)后，65℃水浴2 h破壁，用苯酚、氯仿、異戊醇 (25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，異丙醇沉淀，后用75%乙醇洗滌，加水溶解，-20℃凍存。

MLST基因分型檢測 根據熱帶念珠菌MLST分型數據庫 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)及Arianna等的報道，選取熱帶念珠菌的6對管家基因，分別是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a，根據數據庫數據合成相應的引物序列，具體見表1。利用合成后的引物擴增臨床菌株各管家基因片段，PCR反應體系包括Ex Taq酶0.25 μL，10×Ex buffer 5 μL (含20 mmol/L Mg2+)，dNTPs 4 μL，50 μmol/L的正向和反向引物各0.4 μL，DNA模板 (200 ng/μL)1 μL和雙蒸水ddH2O 38.95 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共29個循環；72℃延伸5 min。PCR擴增產物與6×loading buffer混勻后加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳孔，在Tanon EPS-300水平式電泳儀中電泳20 min，經Tanon凝膠成像系統證實為單一條帶后，送生工生物工程 (上海)有限公司測序，測序引物與擴增引物相同，測序方法為sanger法，由于熱帶念珠菌為二倍體菌株，所有基因測序均采用正反雙向引物同時測序。

表1 MLST擴增及測序引物

數據分析 利用Chromas 2.22軟件處理熱帶念珠菌各管家基因測序結果。由于熱帶念珠菌是二倍體菌株，對于測序的雜合子位點，根據理論與應用化學國際聯合會 (International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的標準，C/T雜合、A/T雜合、G/T雜合、A/G雜合和C/G雜合分別用Y、W、K、R和S表示。整理后的測序結果與熱帶念珠菌MLST分型數據庫 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)比對，得到各菌株各管家基因的型號，將6個管家基因的型號組合即可得到每個菌株的MLST型號，將本研究中新得到的MLST型別上傳至熱帶念珠菌MLST分型數據庫。利用eBURST V3軟件對臨床熱帶念珠菌的系統進化關系進行分析。

系統發育樹繪制 利用MEGA 6.0軟件，基于菌株MLST型別采用非加權組平均法 (unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構建系統發育樹，并對構建樹進行自檢 (Bootstrap)，重復次數設定為1 000次。

2 結 果

對臨床92株熱帶念珠菌進行MLST分型，得到12種新的管家基因型別，47種DSTs型別。在47種DSTs型別中32種為新型，已將32種新型上傳至熱帶念珠菌MLST數據庫并得到審核。用eBURSTV3軟件對臨床熱帶念珠菌的系統進化關系進行分析，得到7個克隆簇，見圖1，克隆簇1包含5種DSTs (503、504、341、346和519)、克隆簇2包含4種DSTs (507、505、506和376)、克隆簇3包含3種DSTs (516、526和525)、克隆簇4包含3種DSTs (337、522和149)、克隆簇5包含3種DSTs (331、443和394)、克隆簇6包含2種DSTs (520和514)、克隆簇7包含2種DSTs (333和532)。在47種DSTs中，有2種優勢型別DST507和DST376，分別包含16株菌和11株臨床菌株，占17.39%和11.96%，經eBURSTV3軟件分析這兩種DSTs屬于同一種克隆簇。MEGA 6.0軟件建立的系統發育樹如圖2所示，其建樹結果與eBURSTV3分析結果稍有差異，但主要的克隆簇1和克隆簇2結果一致。

圖1eBURSTV3軟件分析結果：分為7個克隆簇和25個單個MLST型別

Fig.1The analysis result of eBURST V3:including 7 clonal clusters and 25 singletons

對基因型別為DST507和DST376的的27株臨床菌株及其他6株屬于單個MLST型別的菌株進行藥敏檢測，根據熱帶念珠菌對氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑的耐藥折點分別為≥8 mg/L, ≥1 mg/L及≥1 mg/L，結果顯示6株屬于單個MLST型別的菌株僅1株對至少一種藥物耐藥，耐藥率為16.67%；而屬于優勢型別的27株臨床菌株中有21株對至少一種藥物耐藥，耐藥率為77.78%，其中有部分菌株來源于同一個患者，見表2。

圖2 基于MLST型別的系統發育進化樹

3 討 論

熱帶念珠菌作為一種條件致病性真菌，正常情況下可定植于人體，如皮膚、呼吸系統、胃腸系統及泌尿系統等，但當患者免疫力低下時，可引起嚴重的系統性感染。研究表明，長期中性粒細胞減少癥、惡性血液腫瘤以及接受骨髓移植是熱帶念珠菌感染的獨立危險因素[4,6]，而由念珠菌引起的尿液或血流感染中，熱帶念珠菌占第一或者第二位[11]。由于抗真菌藥物的廣泛使用，熱帶念珠菌的耐藥現象已成為臨床治療中的問題，Pfaller等[12]的研究稱熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率高于白念珠菌。已有研究發現對棘白菌素類 (如卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈)抗真菌藥耐藥的臨床熱帶念珠菌[13-15]。與白念珠菌類似，熱帶念珠菌耐藥機制主要表現為：菌株細胞膜上藥物相關外排泵表達過度[16]，如CDR1、CDR2、MDR1及SNQ2；藥物作用靶酶的改變，如ERG11、FKS基因突變[13,16]；生物膜的形成以及線粒體缺陷等[17]。

熱帶念珠菌的流行具有地域性區別，而亞洲地區是常見的流行高發區[17-18]。與白念珠菌相比，國內對熱帶念珠菌的研究相對較少，尤其是對其基因型別和流行病學的研究。本研究利用多位點序列分型技術對上海市瑞金醫院92株臨床熱帶念珠菌進行基因分型，分析得到7個克隆簇和2個優勢型別DST507和DST376，有國外研究報道的優勢型別為DST232，與國內不同[19]。本研究中得到的47個DSTs型別，32個為新型，占68.09%，說明臨床上新型熱帶念珠菌出現頻率很高，即管家基因單核苷酸變異率高。本研究中6株屬于單個MLST型別的菌株耐藥率為16.67%，而屬于優勢型別的27株臨床菌株耐藥率為77.78%，雖然菌株CR16、CR17，菌株CR18、CR19、CR21，菌株CR32、CR33分別來自于同一個患者P16、P17和P29，除去此因素，其耐藥率仍為73.91%，這說明熱帶念珠菌基因型別可能與其耐藥相關，已有研究表明熱帶念珠菌基因型別DST98、DST140和DST164與其藥物耐藥有關[20-22]，但也有研究認為這兩者之間無相關性[19]。值得注意的是，屬于優勢型別DST507的16株菌株中，有5株耐藥菌株來源于心臟外科或者心臟外科監護室，5株來源于急診ICU，這提示我們這些臨床分離菌株可能屬于院內患者間互相感染，可能由耐藥菌株不易控制及科室院感質控管理不當等原因導致。

綜上所述，熱帶念珠菌作為一種臨床上耐藥率相對較高的常見條件致病菌，國內對其研究遠低于白念珠菌，我們應在后續的研究中對其予以重視。MLST是一種分辨率高、客觀且各實驗室之間可比性高的基因分型技術，適用于菌株的流行病學調查研究，應在以后的研究中增加樣本量，繼續加強對國內熱帶念珠菌的流行病學研究。

表2 本研究部分菌株藥物敏感性實驗結果