3種方法檢測艾滋病患者血和腦脊液中隱球菌的結果分析

曹宇碩 錢雪琴 蔡金鳳 陳智瑾 趙洋洋 朱召芹 盧洪洲

(1.上海市公共衛生臨床中心檢驗醫學科；2.上海市公共衛生臨床中心感染與免疫科，上海 201508)

艾滋病 (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱為獲得性免疫缺陷綜合征,是因HIV 侵入機體,破壞CD4+淋巴細胞,引起細胞免疫嚴重缺陷，導致患者抵抗力降低，繼發內源性及外源性感染、惡性腫瘤和神經系統病變為特征的臨床綜合征。AIDS患者合并感染常見真菌有莢膜組織胞漿菌、馬爾尼菲籃狀菌、念珠菌屬、隱球菌屬、耶氏肺孢子菌[1]。隱球菌的檢測方法主要有真菌培養、墨汁染色、隱球菌抗原檢測。我們回顧性分析了2017年1～12月本院收治的AIDS患者不同隱球菌檢測方法的結果，以期篩選出診斷AIDS合并隱球菌感染較好的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

標本來源于2017年1～12月，本院收治并確診的1 049例艾滋病患者的血液和腦脊液。

1.2 主要試劑

VITEK 2 YST酵母菌鑒定卡為法國梅里埃生物公司生產，成人中和抗生素培養瓶為美國Becton,Dickinson and Company公司生產，血平板和沙氏培養基購自上海科華微生物試劑有限公司，新生隱球菌抗原試劑盒為美國IMMY公司生產，墨汁染液為珠海貝索生物技術有限公司生產。

1.3 方法

真菌培養和鑒定：抽取腦脊液標本1～5 mL和全血標本5～10 mL,分別注入BD FX需氧培養瓶，待儀器報警顯示陽性時，取出標本，用注射器吸取少量標本，分區劃線接種于血瓊脂平板和沙氏培養基，分別置于35℃和25℃孵育箱中培養12～24 h，用YST酵母菌生化鑒定卡對其進行菌種鑒定。刮取培養基上真菌菌落，用0.45% NaCL 3 mL調成1.8～2.2 McF真菌懸液，借助VITEK 2鑒定儀，將菌液注入YST鑒定卡的微量生化孔中，鑒定儀通過比色或比濁自動判讀生化反應結果，鑒定是否為新生隱球菌。

墨汁染色:將收集的腦脊液高速離心，3 000 g離心10 min，棄上清，沉淀約以5∶1比例與墨汁混勻鏡檢，在黑色背景下見到出芽或不出芽、大小不均的菌體和透亮的寬厚莢膜為陽性。

側向免疫層析法 (LFA)：常規方法收集腦脊液和全血樣本，1 000 g離心15 min，樣品無需預處理，于試管中滴入1滴標本稀釋液，用微量加樣器取40 μL的腦脊液或血清加入試管中，隨后將隱球菌抗原檢測試紙條的白端沒入到混懸液，室溫孵育10 min后進行結果判讀。判讀標準：對照區存在紅色條帶，檢測區無紅色條帶表明檢測結果為陰性；對照區存在紅色條帶，同時檢測區也存在紅色條帶表明檢測結果為陽性；對照區無紅色條帶存在，無論檢測區有無紅色條帶均表明此次檢測結果無效，應查找原因。

統計學方法:統計學分析采用SPSS 14.0統計軟件包進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05差異有統計意義。

2 結 果

2.1 腦脊液墨汁染色結果

328例AIDS患者腦脊液墨汁染色，59例陽性，陽性率為17.99%。

2.2 真菌培養結果

對688例AIDS患者血標本進行真菌培養，19例培養出新生隱球菌，陽性率為2.8%；對316例AIDS患者進行腦脊液真菌培養，29例培養為新生隱球菌，真菌培養陽性率為9.18%；其中189例患者的血和腦脊液標本均進行了真菌培養，17例患者血標本培養出新生隱球菌，陽性率為8.99%，腦脊液培養檢出新生隱球菌22例，陽性率為11.64%。腦脊液真菌培養陽性率高于血培養，差異無統計學意義 (χ2=0.71，P>0.05)。血與腦脊液標本培養結果一致性具體見表1。

表1189例艾滋病患者血與腦脊液標本培養結果一致性比較

Tab.1Comparison of the results of blood and cerebrospinal fluid culture in 189 AIDS patients

血液培養腦脊液培養陽性陰性合計陽性14317陰性8164172合計22167189

2.3 腦脊液培養隱球菌檢出率與墨汁染色結果一致性比較

313例患者同時做腦脊液墨汁染色和真菌培養，墨汁染色陽性57例，陽性率為18.21%；真菌培養陽性29例，陽性率為9.27%，腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養陽性率，差異有統計學意義 (χ2=10.57，P<0.01)，兩者一致性比較見表2。

表2313例艾滋病患者腦脊液培養與墨汁染色結果一致性比較

Tab.2Comparison of cerebrospinal fluid culture and ink staining results in 313 AIDS patients

腦脊液培養腦脊液墨汁染色陽性陰性合計陽性26329陰性31253284合計57256313

2.4 側向免疫層析法檢測結果

1 049例AIDS患者進行側向免疫層析法檢測，陽性115例，陽性率為10.96%，其中956例患者血標本側向免疫層析法檢測，陽性101例，陽性率為10.56%；294例患者腦脊液進行側向免疫層析法檢測，70例陽性，陽性率為23.81%；201例患者同時做腦脊液和血側向免疫層析法檢測，腦脊液陽性56例，陽性率為27.86%，血陽性75例，陽性率37.31%，血側向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液，差異有統計學意義 (χ2=4.09，P<0.05)。兩種標本聯合檢測一項或兩項陽性例數為76例，陽性率為37.81%。兩者一致性見表3。

表3201例艾滋病患者腦脊液和血標本側向免疫層析法檢測結果一致性比較

Tab.3Comparison of the results of lateral immunochromatographic assay between cerebrospinal fluid and blood samples of 201 AIDS patients

腦脊液檢測血標本檢測陽性陰性合計陽性55156陰性20125145合計75126201

2.5 腦脊液墨汁染色與側向免疫層析法檢測結果比較

292例AIDS患者同時做腦脊液墨汁染色和側向免疫層析法檢測，墨汁染色陽性57例，陽性率19.52%，腦脊液側向免疫層析法檢測陽性70例，陽性率為23.97%，腦脊液側向免疫層析法檢測陽性率大于墨汁染色法，差異無統計學意義 (χ2=1.70，P>0.05)。聯合檢測一項或兩項陽性例數為73例，陽性率為25%。詳見表4。3例墨汁染色陽性，腦脊液側向免疫層析法檢測陰性者，有2例血清側向免疫層析法檢測陽性，滴度分別為1∶2 560和1∶80。

表4292例艾滋病患者腦脊液墨汁染色與側向免疫層析法檢測結果一致性比較

Tab.4Comparison of the results of cerebrospinal fluid ink staining and lateral immunochromatography in 292 AIDS patients

腦脊液墨汁染色腦脊液側向免疫層析法檢測陽性陰性合計陽性54357陰性16219235合計70222292

2.6 血真菌培養與側向免疫層析法檢測結果一致性

338例AIDS患者同時做血真菌培養和側向免疫層析法檢測，血真菌培養新生隱球菌陽性5例，陽性率為1.48%；側向免疫層析法檢測陽性13例，陽性率為3.85%。側向免疫層析法檢測陽性率高于血真菌培養，差異無統計學意義 (χ2=3.65，P>0.05)。兩者聯合檢測一項或兩項陽性14例，陽性率為4.14%。兩者一致性比較具體見表5。

2.7 腦脊液真菌培養與側向免疫層析法檢測結果比較

284例AIDS患者同時做腦脊液培養與側向免疫層析法檢測，腦脊液真菌培養陽性25例，陽性率為8.80%；側向免疫層析法檢測陽性68例，陽性率為23.94%，側向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液培養，差異有統計學意義 (χ2=23.77，P<0.01)。兩者一致性具體見表6。

表5338例艾滋病患者血培養與血側向免疫層析法檢測結果一致性比較

Tab.5Comparison of the results of blood culture and blood lateral immunochromatographic assay in 338 patients with AIDS

血真菌培養血側向免疫層析法檢測陽性陰性合計陽性415陰性9324333合計13325338

表6284例艾滋病患者腦脊液培養與側向免疫層析法結果一致性比較

Tab.6Comparison of results of cerebrospinal fluid culture and lateral immunochromatography in 284 AIDS patients

腦脊液真菌培養腦脊液側向免疫層析法陽性陰性合計陽性24125陰性44215259合計68216284

3 討 論

有文獻報道發達國家AIDS患者未經抗逆轉錄病毒之前，隱球菌播散性感染發生率為5%～8%[2]。本院收治的AIDS患者中，隱球菌播撒性感染率為10.56%稍高于文獻報道。

隱球菌感染檢測方法中，墨汁染色是最常用的方法，操作簡單，用時短，約需2 min，陽性率為54%～74%[3]。艾滋病合并隱球菌性腦膜炎患者，墨汁染色的敏感性為80%～85%[4]，可快速診斷隱球菌感染。其適用的標本類型為無菌體液、尿液等，灌洗液、支氣管刷取物和少量痰加水漩渦振蕩后，取上清，也可進行墨汁染色。體液標本經離心沉淀后再進行墨汁染色，可提高陽性率。本院采用離心沉淀后墨汁染色，328例AIDS患者腦脊液隱球菌檢出率為17.99%。墨汁染色結果易受菌量多少、實驗室人員技術能力、墨汁質量等影響，造成假陽性和假陰性結果出現。一般腦脊液和墨汁的比例為5∶1左右為宜，最好選用接種槍加墨汁和標本，即取10 μL墨汁和50 μL腦脊液混勻，小心蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，用筆輕壓，先低倍鏡觀察，以見到細小墨汁顆粒為找到視野，再觀察全片，低倍鏡下閱片不少于300個視野，當黑色或棕色背景下看到無色的、很亮的暈圈，暈圈內可見清晰圓形或橢圓形孢子，再轉高倍鏡確認，隱球菌高倍鏡下可見到完整光滑細胞壁及胞內脂質顆粒。若低倍鏡下，僅看到漆黑，為墨汁量過多，可輕壓蓋玻片，用濾紙吸去多余染液再觀察，否則易造成假陰性結果。低倍鏡觀察時，要先將聚光鏡下調，光圈縮小，可觀察到隱球菌清晰的細胞壁。選擇顆粒細的墨汁為佳，根據墨汁不同，適當調整腦脊液與墨汁的比例，可有效提高墨汁染色隱球菌的檢出率。墨汁染色時，紅酵母菌和白吉利毛孢子菌可造成假陽性結果。有文獻報道將阿利新藍染色用于腦脊液隱球菌的檢測，檢出陽性率也可達80%～90%[5]，隱球菌經阿利新藍染色后，莢膜可被染成深藍色，菌體呈淡藍色，而周圍的炎性細胞不著色，染色對比清晰，當隱球菌數目少時也容易觀察，較傳統墨汁染色隱球菌檢出率高，有條件的實驗室可考慮使用。

真菌培養是通過對標本進行培養和鑒定，判斷患者是否發生隱球菌感染，一般需要28℃和35℃培養3～4 d,個別新生隱球菌需要延長培養時間到1周以上，為現階段臨床檢查新生隱球菌的金標準，與涂片和隱球菌抗原檢測相比，培養時間長，不利于患者病情的早期診斷。據文獻報道[4]合并感染隱球菌腦膜炎的艾滋病患者，其腦脊液和血標本真菌培養的敏感性分別為90%和50%～70%，其中腦脊液培養敏感性隨著標本量增加而增高 (10 μL時為82%，100 μL時94%)。本院688例AIDS患者血標本真菌培養,新生隱球菌的檢出率為2.8%，與吳開進[6]報道的2.3% (6/259)血真菌培養陽性率相近。316例AIDS患者腦脊液真菌培養陽性率為8.2%。313例患者同時做了腦脊液墨汁染色和真菌培養，墨汁染色陽性率為18.21%；培養陽性率為9.27%，腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養陽性率。由于本實驗室血液及無菌體液真菌增菌培養使用的是一般菌需氧培養瓶，而未使用真菌專用培養瓶，培養條件為35℃，5 d，部分隱球菌可能由于培養時間短而漏檢；有部分患者由于已接受過抗真菌預防治療，菌已死而抗原存在，出現墨汁染色陽性而培養陰性。本院真菌培養陽性菌株，經VITEK 2系統鑒定，均為新生隱球菌，有文獻報道[7]，API 20C系統、Vitek全自動微生物鑒定儀或MicroScan全自動微生物鑒定系統等，目前尚無法區分新生隱球菌及格特隱球菌，德國布魯克公司的MALDI TOF MS不僅能準確區分格特隱球菌和新生隱球菌，還可進行分子分型。

隱球菌抗原 (CrAg)檢測具有很高的敏感性及特異性，可在癥狀出現之前檢測到。目前常用的檢測方法有3種，分別是乳膠凝集法 (LA)、酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)和側向免疫層析法 (LFA)。3種方法均利于患者病情的早期診斷，監測隱球菌抗原滴度的下降，可作為抗隱球菌療法有效的指示。據文獻報道[4]以培養為金標準，LA在血標本和腦脊液的敏感性分別為83%～97%和93%～100%，特異性分別為93%～100%和93%～98%。ELISA法敏感度高于LA法，其檢測血標本的敏感性和特異性分別為94%和96%，檢測腦脊液的敏感性和特異性分別為100%和98%，但操作繁瑣，需要配置額外設施，對新生隱球菌 (血清型D)和格特隱球菌 (血清型C)檢測敏感性低。LA具有檢測需要時間短，操作方便，其局限性為結果判讀受人為因素影響較大，需要對標本進行前處理，對格特隱球菌 (血清型C)敏感性低。ELISA法和LA法試驗的假陽性率為0.0%～0.4%[7]。本文采用的是LFA法，該方法是IMMY公司繼乳膠凝集法后新研發的試劑盒，其在常溫狀態下性質穩定，操作簡便且耗時短 (10 min)，對結果的判定簡單、準確，標本不需前處理，敏感性高于LA法和ELISA法[8]。對所有血清型新生隱球菌和格特隱球菌均有很高的敏感性。有文獻報道LFA對隱球菌病的診斷敏感性和特異性可達到100%，特別是檢測低濃度的莢膜抗原方面，與LA相比具有更高的敏感性[9]。本文中1 049例AIDS患者進行LFA法檢測，陽性率為10.96%；201例同時做腦脊液和血標本的LFA法檢測，腦脊液陽性56例，陽性率為27.86%，血標本陽性75例，陽性率37.31%，有文獻報道當CSF中隱球菌莢膜抗原檢測為陽性時，血液中檢測其敏感性可達99%，應用LFA檢測指尖血、血清、血漿和腦脊液，CrAg的結果一致性100%[10]，說明檢測指尖血CrAg簡單可行性；應用LFA檢測尿液及唾液中CrAg的效果差，有待進一步研究[11]。對于3例墨汁染色陽性，腦脊液LFA法檢測陰性者，其中2例血清LFA法檢測陽性，具體原因待研究。

總之，通過回顧性分析2017年本院收治的AIDS患者標本，用3種方法檢測隱球菌的陽性率，以血培養陽性率最低，腦脊液標本墨汁染色與LFA法檢測陽性率差異無統計學意義，血標本LFA法檢出率最高，可作為AIDS患者合并隱球菌感染較理想的早期診斷方法。