采用微量液基稀釋法對伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性探索性研究

萬喆 侯晴,2 李若瑜 王愛平

(1.北京大學第一醫院皮膚性病科 北京大學真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.上海長征醫院皮膚科，上海 200003)

伊可爾?抗菌劑是一種純中藥復方外用溶液，按照產品的說明書由苦參、金銀花、大青葉、五倍子等為主要原料精制而成，其中乙醇含量為15%～25%，苦參含量為18 g/L，金銀花含量為16 g/L，大青葉含量為16 g/L，五倍子含量為16 g/L。適用于皮膚抗菌，可殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白念珠菌。該中藥復方外用溶液在體外是否具有抗真菌活性？抗真菌活性效果如何？是否能采用國際上公認的美國國家臨床實驗室標準化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的M-38 A2 (皮膚癬菌)和M27-A3 (酵母菌)方案進行體外藥敏試驗？由于伊可爾?抗菌劑是一種復方中藥外用溶液，含有一定量的乙醇溶液及沉淀物，因此，本研究先采用CLSI M-38 A2 (皮膚癬菌)和M27-A3 (酵母菌)微量液基稀釋法對皮膚科最常見的紅色毛癬菌及白念珠菌各1株菌進行了體外藥物敏感性測定預試驗，并對伊可爾?抗菌劑原液含乙醇與除乙醇進行比較，過濾與不過濾進行比較。根據預試驗的結果，本研究對皮膚癬菌病中常見的兩種致病菌即紅色毛癬菌和趾間毛癬菌各10株菌進行了體外藥敏試驗，目的是采用微量液基稀釋法對中藥復方溶液體外抗真菌活性進行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 受試藥物

伊可爾?抗菌劑原液 (乙醇含量為15%～25%)及其除乙醇原液均由北京派特博恩 (天津)生物技術開發有限公司生產，許可證號 (津)衛消證字 (2017)第01號。規格：15 mL/瓶。伊可爾?抗菌劑測試樣品見表1。根據預試驗結果，最終采用了伊可爾?抗菌劑原液過濾 (乙醇含量為15%～25%)進行體外藥敏試驗。

表1 伊可爾?抗菌劑的測試樣品

1.2 受試菌株

預試驗菌株包括紅色毛癬菌 (BMU-08583)1株和白念珠菌 (BMU-05260)1株。之后的受試菌株包括紅色毛癬菌10株，趾間毛癬菌10株，均來自北京大學第一醫院皮膚性病科、北京大學真菌和真菌病研究中心分離保藏菌株。

1.3 培養基

按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液體培養基。

1.4 菌種培養和鑒定

預試驗菌株和受試菌株均采用表型 (形態學)、生理生化及分子生物學的鑒定方法進行了鑒定。

1.5 體外藥敏試驗方法

紅色毛癬菌和趾間毛癬菌參照CLSI M38-A2微量液基稀釋法進行測定；白念珠菌參照CLSI M27-A3微量液基稀釋法進行測定。

1.6 藥敏板制作

將伊可爾?抗菌劑原液 (四種)1∶1稀釋的藥物作為第1孔濃度由高到低依次倍比稀釋成10個藥物濃度，即1∶1～1∶512；加入微量藥敏板 (96孔酶標板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分別加入100、200 μL相應液體培養基，分別作為生長對照和空白對照，-20℃保存備用。

1.7 菌液制備及接種

將紅色毛癬菌和趾間毛癬菌菌株轉種于PDA培養基上28℃培養生長5～7 d。用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，使用比濁儀調整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，再用RPMI-1640培養基稀釋菌液50倍使其菌含量為 (2～10)×104CFU/mL。在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (1～5)×104CFU/mL。

將白念珠菌菌株轉種于SDA上35℃培養生長24～72 h，制成菌懸液，使用比濁儀調整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，先用RPMI-1640培養基稀釋菌液20倍，再稀釋50倍使其菌含量為 (1～5)×103CFU/mL，在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (0.5～2.5)×103CFU/mL。

1.8 培養

紅色毛癬菌和趾間毛癬置于35℃恒溫培養，4～7 d看結果。白念珠菌置于35℃恒溫培養24～72 h看結果。

1.9 結果判定

按照CLSI制定的標準進行結果判讀。只有當生長對照生長良好，方認為試驗成功，可進行結果判讀。由于每次試驗均設置對照，一般情況下的藥敏試驗每株菌進行一次檢測。對于中藥復方溶液進行體外藥敏試驗經驗不足，本研究為確保試驗準確性，每株菌同時進行了二次藥敏試驗，按照判斷原則，只要二次測定結果在二個稀釋度范圍內，屬于允許誤差，表明兩次測定一致性好，試驗成功。

2 結 果

2.1 對紅色毛癬菌和白念珠菌預試驗

伊可爾?抗菌劑含乙醇原液 (過濾與未過濾)對白念珠菌的最小抑菌濃度 (MIC)均為1∶8；對紅色毛癬菌的MIC分別為1∶64和1∶128。伊可爾?抗菌劑除乙醇原液 (過濾與未過濾)對白念珠菌的MIC均為1∶16；對紅色毛癬菌的MIC均為1∶128。伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性預試驗結果見表2。

表2伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性預試驗結果

Tab.2Preliminary results of antifungal activityinvitrofor yikeer?antimicrobial agent

菌種 (株數)MIC伊可爾?抗菌劑含乙醇(過濾)伊可爾?抗菌劑除乙醇(過濾)伊可爾?抗菌劑含乙醇(原液)伊可爾?抗菌劑除乙醇(原液)白念珠菌 (1)1∶81∶161∶81∶16紅色毛癬菌 (1)1∶641∶128 1∶128 1∶128

預試驗結果提示伊可爾?抗菌劑具有一定的體外抗真菌活性，尤其對紅色毛癬菌的作用更明顯，MIC為1∶128 (即對伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋8倍的結果)。對白念珠菌亦有抗菌活性，MIC為1∶8～1∶16 (即對伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋4～5倍的結果)。結果顯示含乙醇和不含乙醇溶液的伊可爾?抗菌劑對體外藥敏試驗結果基本無影響，說明乙醇無抗真菌活性，真正的抗真菌活性來自于伊可爾?抗菌劑中的中藥成分。結果顯示過濾和不過濾的伊可爾?抗菌劑原液對體外藥敏試驗結果亦無影響，說明真正的抗真菌活性亦來自于伊可爾?抗菌劑原液中的中藥成分，但過濾后觀察藥敏板的菌落生長情況更加清晰。

2.2 對紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外抗真菌活性

伊可爾?抗菌劑體外對紅色毛癬菌的MIC在1∶64～1∶256；對趾間毛癬菌的MIC在1∶64～1∶128。每株菌兩次試驗測定結果一致性好。伊可爾?抗菌劑對紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外抗真菌活性見表3。

表3伊可爾?抗菌劑對紅色毛癬菌和趾間毛癬菌的體外抗真菌活性 (MIC)

Tab.3Antifungal activityinvitrotoT.rubrumandT.interdigitale(MIC) for yikeer?antimicrobial agent

菌種株數1∶321∶641∶1281∶2561∶512紅色毛癬菌1004420趾間毛癬菌1007300合計20011720

3 討 論

伊可爾?抗菌劑是一種純中藥復方外用溶液，系中科院采用超臨界二氧化碳萃取技術精制而成。主要成分為鴉膽子、大青葉、苦參、蛇床子等，其中鴉膽子含有多種生物堿類、苦味素及油酸等，其藥理作用是選擇性破壞癌細胞膜和線粒體等膜性系統，使癌細胞發生退行性變或壞死，同時對感染的HPV合成復制具有抑制和清理作用。大青葉、苦參中含有大量的鞣質、醇類、皂甙等物質，具有強效的抗菌、抗病毒作用，可干擾、阻止HPV的DNA合成，抑制病毒生長與繁殖，同時具有清熱解毒、活血散瘀、提高和激活皮膚免疫的作用[1-2]。

近年來，國內外對中藥單體抗真菌作用有一些相關報道，盧詳婷[3]對10種中藥提取物抗念珠菌體外藥敏試驗結果顯示三七總皂甙、人參莖葉皂甙、檸檬酸和麝香草酚對念珠菌具有一定的抗菌活性，不同的中藥提取物針對念珠菌不同菌種的抗真菌作用存在一定差異。周艷萌等[4]采用結晶紫和XTT兩種方法均測出厚樸煎煮液對白念珠菌黏附具有抑制作用，發現XTT法能更確切地檢測厚樸煎煮液對白念珠菌的黏附抑制作用。但對于中藥復方溶液抗真菌作用的研究罕見有報道。伊可爾?抗菌劑是一種中藥復方溶液，目前主要用于HPV相關疾病的治療，取得了良好的療效。本研究顯示伊可爾?抗菌劑對于紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外具有明顯的抗真菌活性，對于紅色毛癬菌的MIC在1∶64～1∶256，即對伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋到7～9倍具有抗真菌作用。對趾間毛癬菌的MIC在1∶64～1∶128，即對伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋到7～8倍具有抗真菌作用。初步的研究顯示伊可爾?抗菌劑作為一種中藥復方溶液在體外具有一定的抗皮膚癬菌活性。采用CLSI M-38 A2微量液基稀釋法對皮膚癬菌進行中藥復方溶液體外抗真菌菌活性研究是可行的，具有實驗結果易分析、方便、可重復性等優點。本研究僅對兩個菌種各10株菌進行了探討性體外藥敏試驗研究，有待于今后擴大樣本數及擴充菌種進一步研究，為從中醫中藥中開發高效低毒的抗真菌藥物提供理論和實驗依據。