2例西弗射盾子囊霉的分離與鑒定

陳菲 周萬青 張之烽

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院檢驗科，南京 210008)

西弗射盾子囊霉 (Stephanoascusciferrii)，又稱西弗念珠菌 (Candidaciferrii)，是一種少見的條件致病性真菌[1]。由于抗生素、免疫抑制劑、激素的廣泛應用，致使條件致病菌的感染機會增多，真菌病原譜也發生了很大變化，給臨床診斷和治療增加了難度。近年來，西弗射盾子囊霉在痰液、腦脊液、腹膜透析液、耳道分泌物、血液中均有分離成功的報道[1-5]。本文對2例西弗射盾子囊霉感染病例進行介紹，從形態學、培養特性及分子生物學等方面來說明檢驗技術對臨床少見病原菌菌種鑒定和治療的重要性。

1 材料及方法

1.1 病例資料

患者1，女，51歲，雙耳間斷性流膿數年，伴聽力下降，常發生于感冒后。患者于1周前癥狀加重，于2017年6月21日來我院就診并以“雙側慢性化膿性中耳炎”收入院。入院后專科檢查見雙側鼓膜緊張部穿孔，鼓室內見少量膿性分泌物；聽力檢查示雙側中度傳導性聽力下降。實驗室檢查：血常規、生化、凝血未見異常，送檢雙份耳分泌物培養，均檢出西弗射盾子囊霉。6月25日在全麻下行“左鼓室成形術+外耳道成形術+后上鼓室探查”手術同時予氟康唑抗感染，術后切口愈合好，無紅腫滲出，準予術后1周出院。術后3個月隨訪未見異常。

患者2，男，59歲，因“肝移植術后1年余，反復膚黃尿黃眼黃伴發熱7個月” 于2017年11月21日入院。患者既往因原發性膽汁性肝硬化導致肝衰竭行肝移植術、肝內膽管結石行PTCD術、經皮腎鏡碎石取石術+經皮膽道取石術，另有腰椎陳舊性骨折、陳舊性腔隙性腦梗死等基礎疾病。入院查體：體溫38.9 ℃，脈搏112次/min，呼吸27次/min，血壓135/87 mmHg，皮膚鞏膜黃染，腹軟，無壓痛反跳痛。實驗室檢查：WBC 3.1×109/L，Neu 60%，Hb 62 g/L，C反應蛋白104.3 mg/L。腹部CT示肝內膽管結石，肝內包裹性積液；心臟超聲示左心舒張功能減退。T管引流膽汁培養檢出肺炎克雷伯菌與西弗射盾子囊霉。真菌葡聚糖495 pg/mL，真菌GM試驗陰性。臨床行比阿陪南+氟康唑抗感染治療，培菲康調理腸道。2 d后患者熱峰較入院時下降 (38.1℃)，提示抗感染治療有效。但由于患者長期服用免疫抑制劑，基礎免疫力極低，感染未完全糾正，反復發熱，血鉀仍在較低水平，并于12月6日出現呼吸、心率、血氧飽和度下降，搶救無效死亡。

1.2 試劑與儀器

Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統及配套YST鑒定卡、ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測條、哥倫比亞血瓊脂平板 (法國梅里埃公司)；科瑪嘉顯色平板、沙保弱斜面培養基 (鄭州博賽)；營養肉湯 (上海科瑪嘉公司)；DNA提取試劑盒 (Qiagen)；PCR試劑 (上海生工公司)；引物及序列測定由上海生工公司完成。

1.3 細菌培養與鑒定

對于病例1，將耳分泌物標本直接接種哥倫比亞血平板，培養24 h后菌落涂片為真菌，轉種科瑪嘉顯色平板以及沙保弱斜面培養基，分別置于35℃及28℃培養，24 h后連續觀察菌落形態。經革蘭染色后觀察菌體形態。Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統及配套YST鑒定卡進行鑒定。

對于病例2，將膽汁標本置肉湯增菌24 h后轉種哥倫比亞血平板，繼續培養24 h后菌落涂片為真菌，轉種科瑪嘉顯色平板以及沙保弱斜面培養基，分別置于35℃及28℃培養，24 h后連續觀察菌落形態。經革蘭染色后觀察菌體形態。Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統及配套的YST鑒定卡進行鑒定。

1.4 分子生物學鑒定

采用德國Qiagen試劑盒提取菌株DNA。參照文獻[6]對真菌ITS1、ITS4進行PCR擴增。引物序列為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR體系為50 μL：2×Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌蒸餾水21 μL。反應條件參考文獻進行。陽性產物委托上海生工公司進行雙向測序，并將測序結果經PubMed進行Blast比對。

1.4 藥敏試驗

采用ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測條進行藥敏試驗，35℃孵育24 h后讀取結果，具體參見試劑說明書進行。

2 結 果

2.1 菌落特征

2株菌株在哥倫比亞血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板和沙保弱斜面培養基上均能生長，且菌落形態相似。科瑪嘉顯色平板上菌落特點：24 h菌落為無色，針尖狀，接種環不易刮起，生理鹽水中不易研磨；48 h后菌落稍大，逐漸顯藍綠色，72 h后菌落為藍綠色，開始粗糙，凸出平板生長，1周后菌落呈規則圓形，灰藍色，菌落中心明顯凹陷 (見圖1a)。

2.2 鏡下特征

科瑪嘉顯色平板上培養24 h后涂片，革蘭染色見菌絲，樹枝狀 (見圖1b)；1周后取菌落涂片，見大量菌絲孢子，孢子沿菌絲周邊分布 (見圖1c)。

圖1西弗射盾子囊霉培養菌落及革蘭染色結果：a.科瑪嘉顯色平板35℃培養1周；b.科瑪嘉顯色平板35℃培養24 h革蘭染色 (×1 000)；c.科瑪嘉顯色平板35℃培養1周革蘭染色 (×1 000)

Fig.1The colonial morphology and Gram staining results ofStephanoascusciferrii: a. Colonial morphology on CHROM agar at 35℃ for 1 week; b. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 24 h (×1 000); c. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 1 week (×1 000)

2.3 生化鑒定

Vitek 2 Compact配套YST酵母菌鑒定卡鑒定結果為西弗射盾子囊霉，生物編碼分別為6713567572777771，6713167572777571，可信度分別為97%與95%，重復鑒定結果一致。

2.4 分子生物學鑒定

經ITS測序及PubMed上Blast比對，2株菌序列與Trichomonascusciferrii(序列號:LC158132.1)同源性均為100%。

2.5 體外藥敏結果

經ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測，2菌株體外最低抑菌濃度 (MIC)分別為：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、兩性霉素 B≤0.5 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。

3 討 論

子囊菌隸屬于真菌界 (Fungi)、子囊菌門 (Asco-mycota)、酵母綱 (Saccharomycetes)、酵母目 (Saccha-romycetales)、酵母菌科 (saccharomycetales)、子囊菌屬 (Stephanoascus)[7]，西弗射盾子囊霉與孢子絲菌屬和念珠菌屬同源，但在形態特征差別較大，可通過有性繁殖在子囊中產生子囊孢子[8]。該菌是一種較為少見的條件致病菌，可在宿主免疫功能低下時導致感染[9]。本文2例患者，患者1常在感冒時出現雙耳流膿；而患者2由于肝移植術后長期服用免疫抑制劑，機體處于免疫抑制狀態，繼發膽道感染，由于患者基礎免疫力極低，臨床抗感染治療效果不佳。

由于西弗射盾子囊霉較為少見，對該菌的鑒定尤為重要。該菌在血平板、沙保弱培養基等臨床常用培養基上均可生長，在科瑪嘉顯色平板上為灰藍色凸起菌落，邊緣整齊，隨著培養時間的延長，菌落會出現凹陷，鑲嵌于平板中，不易刮起，不易研磨。革蘭染色涂片，可見菌絲，真菌孢子呈卵圓形沿菌絲排列。但僅僅靠上述特征進行鑒定較為困難。傳統的真菌分類方法主要根據真菌的形態學、生理生化特點及生理生化指標來進行分析，但由于某些真菌屬、種之間的形態學或生理生化差異極不顯著，且真菌的培養和檢出需要特殊培養條件和方法以及多數真菌的生長緩慢等特點的影響，給真菌鑒定工作帶來困難[10]。分子生物學技術具有快速、靈敏、特異性高的特點，已被廣泛運用于臨床感染的診斷中，包括深部真菌感染的早期診斷。目前, 這些分子生物學檢測方法多聚焦于對rDNA的內部轉錄間隔區 (internaltranscribedspacer,ITS)序列分析的研究，rDNA-ITS由于不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速率較快，具有廣泛的序列多態性，在其保守性上表現為在種內不同菌株之間高度保守，而在真菌種間差異明顯，這種特點使得ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析[11]。在臨床檢驗工作中，不僅要熟練掌握基本的檢驗技術，如涂片鏡檢及觀察菌落特點，更要學會將傳統的培養法與分子生物學技術相結合，提高檢驗水平，早期快速、準確可靠地幫助臨床診斷。

本文分離菌株藥敏結果顯示5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑均敏感。國外有分離出對抗真菌藥物氟康唑耐藥的菌株[12]。由于ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測條推薦用于念珠菌與隱球菌藥敏測試，用于西弗射盾子囊霉還有待進一步研究[1]。