EpCAM在前列腺癌中的表達及其相關臨床意義

張繼君　張桂平　韓小璐　劉薇薇　陶麗麗

【摘要】 目的：研究上皮特異性黏附分子（EpCAM）在正常前列腺組織、前列腺癌組織和骨轉移性前列腺癌組織中的表達情況，并探討其表達水平與臨床病理特征及預后的關系。方法：結合公共數據庫中的前列腺癌資料，分析EpCAM的mRNA和蛋白質表達水平。收集2014-2018年深圳市南山區人民醫院及北京大學深圳醫院正常前列腺標本18例、原發性前列腺癌71例、骨轉移性前列腺癌標本12例。采用免疫組化EnVision法檢測EpCAM蛋白在不同組織內的表達，并分析EpCAM的表達水平與前列腺腺癌臨床病理特征的關系。結果：TCGA數據庫、Human Protein Atlas數據庫的分析結果顯示，正常前列腺組織中EpCAM的mRNA和蛋白質水平明顯低于前列腺癌組織（P<0.05）;EpCAM在不同種族、年齡及Gleason評分組之間前列腺癌組織中表達比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;與正常前列腺組織相比，前列腺癌FLI1+亞型和IDH1突變亞型的EpCAM表達未明顯增加（P>0.05）;前列腺癌組織內EpCAM的DNA啟動子序列甲基化水平低于正常前列腺組織（P<0.05），但不同年齡組前列腺癌之間的甲基化水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。免疫組化檢測結果顯示，前列腺癌組織中EpCAM蛋白表達水平高于正常前列腺組織（P<0.05），尤其在前列腺癌骨轉移組織表達更高（P<0.05）;在不同pT分期及Gleason評分的前列腺癌中EpCAM的蛋白水平比較差異均有統計學意義（P<0.05），而脈管及神經束侵犯組與其未侵犯組EpCAM蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：前列腺癌中EpCAM的mRNA及蛋白水平均高于正常前列腺組織，EpCAM的表達水平與前列腺癌分子分型、臨床T分期、Gleason評分和及骨轉移均密切相關，EpCAM的表達上調可能參與了前列腺癌的發生、進展和骨轉移等過程。

【關鍵詞】 上皮特異性黏附分子 正常前列腺組織 前列腺癌 骨轉移性前列腺癌

Expression and Clinical Significance of EpCAM in Prostate Carcinoma/ZHANG Jijun， ZHANG Guiping， HAN Xiaolu， LIU Weiwei， TAO Lili. //Medical Innovation of China， 2019， 16（28）： 00-006

[Abstract] Objective： To investigate the expression of epithelial-specific adhesion molecule （EpCAM） in normal prostate tissue， prostatic carcimoma tissue and bone metastatic prostatic carcinoma tissue， and the correlations between the expression of EpCAM and its associated clinical data. Method： Combined with prostatic carcinoma data from public databases， mRNA and protein expression levels of EpCAM were analyzed. EnVision method was used to detected the expression of EpCAM in comprehensive tissue studies including 18 normal prostate specimens， 71 primary prostatic carcimoma tissues and 12 metastatic lesions from 2014 to 2018 at the Department of Pathology of Shenzhen Nanshan Peoples Hospital and Peking University Shenzhen Hospital. Statistically analyze the correlation between EpCAM protein and the clinicopathological parameters. Result： The data from TCGA and Human Protein Atlas database showed that the mRNA and protein levels of EpCAM in normal prostate tissues were significantly lower than that in prostatic carcinoma tissues （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of EpCAM in prostatic carcinoma among different races， ages and Gleason groups （P>0.05）. Compared with normal prostate tissue， EpCAM expression in FLI1+ and IDH1 mutant subtypes of prostatic carcinoma were not significantly increased （P>0.05）. EpCAM DNA promoter sequence methylation level in prostatic carcinoma tissue was lower than that in normal prostate tissue （P<0.05）， without significant difference between different age groups （P>0.05）. Immunohistochemistry showed that the expression level of EpCAM protein in prostatic arcinoma tissue was higher than that in normal prostate tissue （P<0.05）， especially higher in prostatic carcinoma bone metastatic tissue （P<0.05）. EpCAM protein expression had significantly difference in different pT stages and Gleason scores of prostatic carcinoma （P<0.05）， with no significant correlation with vascular invasion and nerve invasion（P>0.05）. Conclusion： The mRNA and protein levels of EpCAM in prostatic carcinoma were higher than those in normal prostate tissue.The expression of EpCAM is closely related to the molecular typing， clinical T stage， Gleason score and bone metastasis of prostatic carcinoma. The up-regulated expression of EpCAM may be involved in the occurrence， progression and bone metastasis of prostatic carcinoma.

[Key words] EpCAM Normal prostate tissue Prostate carcinoma Bone metastatic prostate cancer

First-authors address： Shenzhen Nanshan Peoples Hospital， Shenzhen 518000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.28.001

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。前列腺癌的發病率和死亡率在世界不同地區表現出顯著差異，其中以西方國家最高[1]，在2017年全美男性癌癥相關死亡病因中位居第二位[2]。我國前列腺癌發病率總體較低，但近年隨著人口老齡化及生活條件的改善，發病率有明顯增加的趨勢[3]。上皮細胞黏附分子（epicell adhesion molecular， EpCAM），又稱CD326，屬于黏附分子家族，是一種跨膜糖蛋白，主要包括3個部分，胞外結構域、單次跨膜結構域和胞內結構域[4]。EpCAM于1979年首次由Herlyn等[5]在結直腸癌中發現，曾經被認為是結直腸癌的主要腫瘤相關抗原。近年來的研究表明，在原代前列腺癌組織和淋巴結轉移中發現過表達EpCAM[6]。目前尚未明確EpCAM在前列腺癌中表達異常的具體機制，以及EpCAM在前列腺癌中表達升高對前列腺癌的發生、進展及其骨轉移的影響。本研究旨在討論EpCAM在良性前列腺組織、原發性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌組織中的表達情況及其可能的機制，并對EpCAM與前列腺癌患者的臨床相關資料進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2014-2018年深圳市第六人民醫院及北京大學深圳醫院良性前列腺組織電切標本18例，前列腺癌根治切除標本49例，前列腺癌穿刺標本22例及骨轉移性前列腺癌例標本12例。所有病例均經過病理確診，共101例標本，患者年齡52～89歲，平均68.8歲。組織學分型：71例根治及穿刺標本組織類型均為經典型前列腺癌，12例骨轉移性病例中1例組織學類型為前列腺癌伴神經內分泌分化，其余11例為經典型前列腺癌。前列腺癌根治標本49例中T分期：pT2a-c組8例，pT3-4組41例;8例見脈管內癌栓;29例見神經束侵犯。

1.2 方法

1.2.1 公共數據庫的驗證 從TCGA數據庫（https：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/TCGA）下載并預處理前列腺癌數據集的mRNA表達數據，TCGA數據集中包含正常前列腺組織和前列腺癌的數據，在Human Protein Atlas數據庫中驗證EpCAM蛋白在前列腺癌中的表達水平。

1.2.2 試劑及免疫組化染色 所有標本均采用10%中性福爾馬林固定，經脫水、石蠟包埋，4 μm厚度切片及免疫組化EnVision兩步法檢測。EpCAM為鼠單克隆抗體，購于北京中杉金橋公司。EpCAM為即用型試劑，具體操作步驟均按照試劑盒說明書進行。PBS代替一抗作為空白對照，采用DAB顯色，蘇木精對比染色。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 EpCAM蛋白表達于細胞胞漿/胞膜，陰性染色屬于無染色或局灶性、弱的非腔緣細顆粒染色，對染色強度及陽性細胞百分數分別進行評判。（1）按陽性腫瘤細胞百分數評分：陽性細胞數占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分。（2）按染色強度評分：陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。將兩項得分之積作為最終得分：總分0～12分，0分為陰性，1～3分為低表達，4～8分為中等程度表達，9～12分為高表達[7]。

1.3 統計學處理 使用SPSS 20.0統計軟件進行處理，計數資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗或者Fisher精確檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數據庫中前列腺癌EpCAM的mRNA及蛋白表達情況 利用TCGA的數據庫分析EpCAM在52例正常前列腺組織與497例原發性前列腺癌中mRNA的表達情況，結果顯示：（1）前列腺癌組織EpCAM的mRNA相對表達水平是正常前列腺組織的2.3倍（268.991/118.773）（P<0.05）;前列腺癌組織EpCAM的mRNA相對表達水平在不同種族（黑人和白人）、不同年齡（41～60歲組，61～80歲組）及不同Gleason評分組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;不同分子亞型前列腺癌EpCAM的mRNA表達水平存在差異，其中ETS家族融合ERG+、ETV1+、ETV4+亞型與SPOP、FOXA1突變亞型前列腺癌相對于正常前列腺組織表達均增加（P<0.05），并且ERG+亞型表達量高于ETV1+亞型和SPOP突變亞型（P<0.05），而FLI1+亞型和IDH1突變亞型的前列腺癌的表達量相對于正常前列腺組織差異無統計學意義（P>0.05），見圖1～3。（2）利用Human Protein Atlas數據庫分析494例前列腺癌EpCAM蛋白表達水平，結果顯示EpCAM蛋白在前列腺癌組織內高表達，見圖4。

2.2 數據庫中前列腺癌EpCAM啟動子序列甲基化水平 β值表示DNA甲基化水平，范圍從0（未甲基化）到1（完全甲基化）。不同的β值截斷被認為是高甲基化（β值0.7～0.5）或低甲基化（β值0.30～0.25）[8-9]。正常前列腺組織中EpCAM的甲基化水平β值介于0.5～0.6，前列腺癌組織中其甲基化水平β值介于0.4～0.5，前者高于后者（P<0.05），而前列腺癌組織EpCAM甲基化水平在不同種族（白人與黑人）及不同年齡（41～60歲，61～80歲）組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

2.3 正常前列腺組織、原發性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌組織中EpCAM蛋白表達情況 EpCAM在正常前列腺組織、原發性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌中表達率分別為8/18（44.4%）、65/71（91.5%）、12/12（100%），并且正常前列腺組織EpCAM蛋白僅為陰性或者低表達（≤1分），而骨轉移性前列腺癌EpCAM蛋白全部為高表達（≥9分），EpCAM在三種組織中表達差異有統計學意義（字2=30.06，P=0.000）。見表1。

2.4 前列腺癌中EpCAM表達與各臨床病理指標間的關系 49例根治性前列腺癌的臨床病理分期、Gleason評分、血管侵襲及淋巴管浸潤情況，見表2。對EpCAM蛋白水平與前列腺癌各臨床病理參數進行統計分析，結果表明：EpCAM蛋白表達在不同T分期及不同Gleason評分中比較差異均有統計學意義（P<0.05），即腫瘤T分期與Gleason評分越高，EpCAM蛋白表達越高;脈管浸潤與神經束侵犯組較對應陰性組EpCAM蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

本研究所提供的數據分為數據庫數據和收集的臨床標本數據，數據庫中包括正常前列腺組織和原發性前列腺癌組織，筆者所收集的標本包括正常前列腺組織、原發性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌。數據庫數據比較詳盡地分析了EpCAM的mRNA表達水平與前列腺癌患者的種族、年齡、Gleason評分及其不同分子亞型之間的關系，同時數據庫還提供了前列腺癌EpCAM的蛋白質表達水平及DNA啟動子序列甲基化情況，本研究又把前列腺癌中EpCAM的蛋白質表達情況及其與臨床病理特征之間的關系分析一次。

目前關于EpCAM的研究不僅限于細胞黏附，還包括干細胞信號傳導、細胞遷移、增殖和分化[10]。關于其對細胞增殖的影響在幾種頭頸部癌癥模型中得到證實[11-13]，而且在乳腺[14]、結直腸癌以及肺癌等腫瘤中也得到驗證[15]。近年來越來越多的數據表明，EpCAM是一個有用的生物標記物，用于腫瘤干細胞的鑒定與分離，或與各種腫瘤中的“干細胞”有關[16-17]。EpCAM是一種跨膜糖蛋白，在包括前列腺癌在內的許多癌癥中高度表達[4，18]。

DNA CpG甲基化參與了基因表達及發育和穩態過程中的調控，甲基化水平改變被認為是人類腫瘤發生的早期事件，可能導致基因表達變化，包括由于CpG島（或富含CpG）啟動子DNA超甲基化引起的基因沉默和由于啟動子的DNA低甲基化引起的基因激活[19]。分析數據庫數據，發現正常前列腺組織與前列腺癌組織中EpCAM的啟動子序列甲基化水平有明顯差異，即正常前列腺組織EpCAM甲基化水平高于前列腺癌組織，這一結論在一定程度上闡明了前列腺癌組織內EpCAM表達異常的可能機制。

在本研究中筆者通過免疫組化方法檢測了EpCAM蛋白在正常前列腺組織、原發性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌組織中的表達，進一步研究EpCAM在前列腺癌轉移和進展中的作用，實驗數據一定程度上驗證數據庫數據，即EpCAM在前列腺癌組織中蛋白表達量明顯高于良性前列腺組織，尤其在伴骨轉移的前列腺癌組織中表達更高，一方面證實EpCAM在前列腺癌進展中發揮重要作用，即促進前列腺癌遠處骨轉移;另一方面詮釋了前列腺癌容易發生骨轉移的可能機制。

關于前列腺癌組織EpCAM表達與臨床參數之間的關系存在相互矛盾的報道。有研究表明前列腺癌EpCAM表達與Gleason評分、根治后進展無顯著相關性[20]，也有研究者通過組織微陣列方法證實EpCAM的過表達與高Gleason級存在顯著相關[21]。筆者研究證實EpCAM的表達水平與前列腺癌Gleason評分密切相關，這一點與數據庫數據結論不一致，同時EpCAM蛋白表達水平與前列腺癌的臨床T分期密切相關，即EpCAM的高表達與高級別前列腺癌、高的臨床T分期有關，這些都是前列腺癌的不良預后因素。同時筆者研究還發現EpCAM蛋白在骨轉移性前列腺癌組織中表達更高，進一步說明EpCAM可能在前列腺癌骨轉移過程中發揮重要作用，當然，本研究收集的骨轉移性前列腺癌標本有限，今后筆者有必要加大樣本含量進一步驗證兩者之間的相關性。

最近Tayama等[22]一項研究證明EpCAM過表達是卵巢癌化療耐藥的獨立危險因素，與順鉑誘導的低水平凋亡作用有關，在卵巢癌中受EpCAM-bcl2軸的調控，即降低EpCAM水平可下調bcl-2表達，同時又上調bax的表達。另一項研究發現，在小鼠模型中EpCAM抗體可以針對EpCAM+抗化療的白血病亞群體，表明EpCAM是一種很有前途治療白血病的新靶點[23]，未來需要進一步研究EpCAM是否能成為前列腺癌靶向治療的突破點。

本實驗中生物信息學分析為筆者研究前列腺癌EpCAM蛋白的表達提供了重要基礎，因此更加全面的了解前列腺癌中EpCAM基因的表達情況及其可能的機制。綜上所述，EpCAM與前列腺癌的發生及進展有密切關系，對其深入的研究可幫助筆者進一步揭示其在前列腺癌中的功能及作用機制，從而為前列腺癌的治療提供新的思路。

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（收稿日期：2019-03-25） （本文編輯：周亞杰）