利用轉基因斑馬魚快速檢測水體抗生素污染

張偉浩 柳賢德 樸伶華

摘要：將轉基因斑馬魚Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）暴露于不同濃度的3種抗生素（鹽酸慶大霉素、硫酸硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素）中24 h，觀察其熒光變化。結果表明，以ABIX野生型斑馬魚胚胎進行毒性試驗，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素的最高合理濃度分別為120、150、240 μg/mL。3種抗生素對CYP1A轉基因斑馬魚幼魚藥物暴露24 h后，鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素分別在2、4、0.4 μg/mL時開始出現熒光。而與對照（0 μg/mL鹽酸萬古霉素）相比，Flk1轉基因斑馬魚胚胎只有當240 μg/mL鹽酸萬古霉素的高濃度暴露下才會出現血管被顯著抑制的效果（P<0.05）。綜上所述，Flk1對這3種藥物的敏感度過低，不適合用于這3種抗生素污染的檢測，而CYP1A轉基因斑馬魚幼魚對這3種抗生素的敏感度都很高，可以作為這些抗生素污染的生物監測手段，這進一步開發了轉基因斑馬魚在水環境檢測氨基糖苷類和糖肽類抗生素污染中的應用。

關鍵詞：抗生素;轉基因斑馬魚;水質檢測

中圖分類號： X832 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0269-04

近年來，在全球各地自然環境中頻繁檢測到抗生素，這些抗生素大多數為人用非處方藥、獸用抗生素和飼料添加劑，其使用量大，持續時間持久，在環境中廣泛存在，對于非靶標生物特別是水生生物的毒性作用逐漸受到重視。以我國為例，2013年全國36種常用抗生素總消耗量約為92 700 t，其中 54 000 t 抗生素經由人和動物排泄到體外，經過各種污水處理系統，最終53 800 t抗生素進入自然環境中[1]。畜牧業使用的抗生素絕大多數以原藥被牲畜排泄物帶進土壤后滲入地下水形成污染;水產養殖中使用的抗生素則有70%～80%最終會進入水環境[2]。目前使用較多的抗生素的種類主要有：β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、大環內酯類、糖肽類抗生素、喹諾酮類等。

斑馬魚（zebrafish，Danio rario）具有個體小、發育周期短、養殖費用低、體外受精、透明、單次產卵數較高以及對污染物的反應快速等優點。更重要的是，斑馬魚的基因與人類基因相似度高達87%，并擁有與人相似的組織器官和系統，被國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）和經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）認定為標準魚類毒性測試生物。水體受到污染物侵入后，魚的生存環境發生轉變，污染物通過魚類鰓呼吸運動、吞食和魚體表面滲入進入體內，繼而魚類的生理活動隨著水體環境的污染程度做出反應[3-4]。其行為變化遵循環境壓力模型，即隨時間經歷穩定、急劇變化、恢復、逐漸消失過程，行為強度會隨污染物濃度和時間而變化[5-6]。相比于斑馬魚成魚，早期生命階段的斑馬魚胚胎因其快速、敏感、高通量和體外測試等優點被逐漸用于環境監測領域，成為環境監測的“哨兵”和“指示兵”[7]。

鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素同屬氨基糖苷類化合物，作為廉價的廣譜性抗菌素，在規模化養殖中使用廣泛，近年來也有鹽酸慶大霉素對雞瘟治理效果很好的相關報道[8]。我國是氨基糖苷類抗生素的主要生產國，至2010年，鹽酸慶大霉素產量突破2 500 t，其他如硫酸卡那霉素、奈替米星等的產量合計近1 000 t[9]。氨基糖苷類抗生素脂溶性差，因此人體和畜禽的胃腸道幾乎不吸收，肌肉注射后大部分以原藥經腎排泄[10]，因此在食物鏈中的富集情況非常嚴重。有研究認為氨基糖苷類抗性基因是在污水、廢水和動物糞便中最頻繁檢出的一類抗性基因[11]，在天然水體中也有檢出[12]，并且很多氨基糖苷類抗性基因與可移動遺傳元件有關。然而氨基糖苷類抗生素及其抗性基因對環境影響的相關研究并不多。鹽酸萬古霉素屬于糖肽類抗生素，其作用機制主要是通過阻礙細菌細胞壁的合成導致致病菌死亡，臨床上主要用于治療嚴重革蘭氏陽性菌感染，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染[13]。因對革蘭氏陽性菌有很強的抗菌效果，所以廣泛用于家禽、家畜等飼料添加劑和獸藥[14]。但這種藥物的濫用導致耐藥菌快速產生。據報道，2003年出現了大量耐鹽酸萬古霉素細菌[15]。因此，我國農業農村部規定將鹽酸萬古霉素列為禁用獸藥。本試驗選用這3種使用比較普遍的抗生素為對象，用生物監測手段觀察轉基因斑馬魚對不同濃度抗生素的反應，以期開發斑馬魚對于水質快速檢測的潛力，使水質抗生素檢測更經濟快捷。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗藥品：鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素（Biotopped，北京）。斑馬魚：ABIX野生型、Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）轉基因型品系購自國家斑馬魚資源中心（CZRC）。儀器設備：斑馬魚養殖系統（愛生科技發展有限公司，北京）;BPC-250 F型生化培養箱（一恒科學儀器有限公司，上海）;X71熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）;一次性吸管、培養皿、塑料六孔細胞培養板（TrueLine，美國）;三卡因甲磺酸鹽麻醉劑（簡稱TMS，CAS編號：886-86-2，Sigma-Aldrich公司，美國）;氯化鈉、碳酸氫鈉等化學藥品均為分析純，購自西隴科學股份有限公司;Heal Force超純水系統（力康集團，香港）。

1.2 3種抗生素的毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗：為保證對照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對毒性評價的干擾，本試驗選擇在受精后48 h（48 hpf）開始暴露藥物。收集到胚胎6 h后，去除異常和死胚，最后挑選出發育正常的胚胎。試驗濃度范圍根據預試驗結果設置，將提前配制的高濃度儲備液用藍水稀釋到不同梯度，包含1個對照組，5個處理組。每個處理組包含3個生物學重復，20個胚胎為1個重復。試驗在6孔板中進行，每孔加入20個健康胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液5 mL，對照組加入等體積藍水。采用半靜態方式進行暴露處理，將培養皿置于恒溫生化培養箱中，暴露總時間為96 h（即從48 hpf～144 hpf），培養箱孵化溫度為（28±0.5） ℃，處理液pH值維持在7，電導率約510 μS/cm，溶氧量>6 mg/L，胚胎保持光 —暗周期為14 h—10 h。毒性試驗對斑馬魚胚胎每24 h更換1次處理液，及時挑出死亡的胚胎。每24 h對斑馬魚胚胎進行1次鏡檢觀察，計量不同時期的各項生理指標和死亡、畸形等數據，進行記錄。

1.3 抗生素對血管發育的影響

3種抗生素的不同濃度對48 hpf的Flk1斑馬魚胚胎暴露24 h，然后用熒光顯微鏡觀察節間血管的直徑。

1.4 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

在對CYP1A和Flk1的試驗中，斑馬魚胚胎于48 h用滅過菌的鑷子顯微鏡下手動破膜，并挑選出正常發育的幼魚。3種抗生素的不同濃度對48 hpf的CYP1A斑馬魚胚胎暴露 24 h，然后用熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.5 試驗時間及地點

試驗于2017年5月至2018年2月，在海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室進行。

1.6 數據統計

CYP1A斑馬魚胚胎觀察其頭部熒光強度，用軟件Image J反轉成灰度值分析出其熒光強度，最終以熒光強度值相互比較;Flk1斑馬魚胚胎觀察其血管發育情況，選取中間部位的節間血管用Image-Pro plus分析出血管的直徑，試驗每組每個濃度胚胎數量至少20個。所有數據用SPSS分析，graphpad作圖。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚胚胎毒性試驗

2.1.1 鹽酸鹽酸慶大霉素對胚胎死亡率的影響 根據預試驗結果，藥物暴露96 h后，900 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，所以筆者選用900 μg/mL為鹽酸慶大霉素的最高濃度。如圖1-A，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素的毒性開始顯露，當鹽酸慶大霉素為180 μg/mL時胚胎開始出現極少數死亡，死亡率只有2.5%。

2.1.2 硫酸硫酸卡那霉素對胚胎死亡率的影響 預試驗結果表明，藥物暴露96 h后，1 000 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，藥物暴露24 h后從200 μg/mL開始出現死亡（圖1-B）。

2.1.3 鹽酸萬古霉素對胚胎死亡率的影響 鹽酸萬古霉素不同濃度暴露96 h后，筆者發現當鹽酸萬古霉素濃度為 1 200 μg/mL 時幼魚全部死亡，因此將1 000 μg/mL設為處理的最高濃度。藥物暴露24 h后當鹽酸萬古霉素濃度為 300 μg/mL 時胚胎開始出現死亡，表明鹽酸萬古霉素的毒性發生點在200 μg/mL濃度持續處理24 h處（圖1-C）。

2.2 抗生素對血管發育的影響

根據抗生素對胚胎處理24 h毒性的影響（圖1），鹽酸慶大霉素選用40、80、120 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;硫酸卡那霉素選用50、100、150 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;鹽酸萬古霉素選用80、160、240 μg/mL濃度處理幼魚。鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素處理組的節間血管發育與對照（0 μg/mL）相比無顯著差異，當鹽酸萬古霉素濃度為240 μg/mL處理時胚胎血管直徑與對照出現顯著差異（P<0.05）（圖2、圖3），節間血管的直徑減少至2 μm以下。

2.3 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

預試驗表明，隨著藥物處理時間的延長，幼魚最先出現綠色熒光的是腦部。由圖4可知，藥物暴露24 h后，這3種抗生素低濃度時可以促進CYP1A蛋白質的表達，并有濃度依賴性。由圖4、圖5可知，2 μg/mL鹽酸慶大霉素處理組開始出現熒光，隨著濃度增加各組間熒光強度逐漸增強并具有顯著差異（P<0.05）;4 μg/mL硫酸卡那霉素處理組開始出現熒光，6 μg/mL處理組的熒光強度是4 μg/mL組的4倍，各組與對照組均具有顯著差異（P<0.05）;其中，CYP1A蛋白對鹽酸萬古霉素的敏感性比鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更強，在0.4 μg/mL處理組就開始出現熒光，相比于氨基糖苷類的鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更敏感。

3 討論

氨基糖苷類抗生素具有較強的腎毒性和耳毒性[16]，其濫用濫排現象已對人類和動物的生存環境構成威脅。鹽酸萬古霉素屬糖肽類抗生素，起初因良好的耐藥菌治療效果在畜牧行業大量使用，因其濫用造成耐鹽酸萬古霉素菌快速形成。這些表明，環境中抗生素的污染不容小覷，因此，抗生素的早期檢測是非常重要的。筆者希望轉基因斑馬魚在作為現代醫學模式動物“寵兒”的同時，也能在水環境監測中起到作用。

Flk1（EGFP）斑馬魚是針對血管發綠色熒光的轉基因斑馬魚，Cross等運用G-RCFP標記插到VEGF2基因的啟動子序列表達，從而得到了有綠色熒光血管的轉基因斑馬魚，能很清楚地觀察到血管的狀態[17]。利用血管的可視化，可以快速準確地看出藥物對血管的作用，本試驗結果表明，鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素在一定濃度下對血管發育沒有明顯影響，而鹽酸萬古霉素在較高濃度時才有抑制血管生成的作用，這說明Flk1轉基因斑馬魚不適用于這3種抗生素的快速檢測。

CYP1A屬于細胞色素P450超家族，廣泛分布于腦、肝及其他很多部位中，參與烴類致癌物的代謝，CYP1A2在肝組織中有特異性表達，參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化[18]。CYP1A轉基因斑馬魚目前在水質檢測方面較多應用于多環芳香烴類化合物的檢測[19]，很少用于其他污染物的檢測。Ohlsen等檢測醫院廢水中的抗生素濃度，其中鹽酸慶大霉素的濃度不低于0.01 mg/L[20]。本試驗數據表明，鹽酸慶大霉素和硫酸硫酸卡那霉素濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL時，CYP1A斑馬魚頭部開始出現熒光。鹽酸萬古霉素濃度為0.4 μg/mL時，幼魚頭部開始出現熒光，這表明CYP1A對鹽酸萬古霉素更敏感。所以CYP1A具有作為氨基糖苷類化合物生物監測手段的潛力。

4 結論

隨著基因工程技術的發展，轉基因斑馬魚技術也越來越成熟。本試驗得出，CYP1A斑馬魚在用于檢測鹵化芳香族碳氫化合物的同時，也可以作為其他部分化合物的生物標記。Flk1斑馬魚對這3種抗生素的敏感程度太低，所以不適合作為這3種抗生素的檢測手段。這說明一種轉基因斑馬魚在用于醫學定向研究的同時可能還具有用于檢測水體中化合物污染的作用，這進一步擴展了轉基因斑馬魚的用途，為水體環境污染的快速監測提供了更經濟方便的手段。

參考文獻：

[1]Zhang Q Q，Ying G G，Pan C G，et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China：source analysis，multimedia modeling，and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology，2015，49（11）：6772-6782.

[2]葉必雄，張 嵐. 環境水體及飲用水中抗生素污染現狀及健康影響分析[J]. 環境與健康雜志，2015，32（2）：173-178.

[3]Depledge M H，Aagaard A，Gyrks P. Assessment of trace metal toxicity using molecular，physiological and behavioural biomarkers[J]. Marine Pollution Bulletin，1995，31（1/2/3）：19-27.

[4]Wang W X. Dietary toxicity of metals in aquatic animals：recent studies and perspectives[J]. Chinese Science Bulletin，2013，58（2）：203-213.

[5]Ren Z M，Zha J M，Ma M，et al. The early warning of aquatic organophosphorus pesticide contamination by on-line monitoring behavioral changes of Daphnia magna[J]. Environmental Monitoring & Assessment，2007，134（1）：373-383.

[6]Li Y，Lee J M，Chon Tae-soo，et al. Analysis of movement behavior of zebrafish （DANIO RERIO） under chemical stress using Hidden Markov model[J]. Modern Physics Letters B，2013，27（2）：1350014.

[7]馬中雨，陳家全，陳興廳，等. 斑馬魚對水源特定污染物的水質監測預警[J]. 中國環境監測，2015，31（1）：146-151.

[8]趙運吉. 鹽酸慶大霉素治雞瘟有特效[J]. 今日畜牧獸醫，2018，34（7）：81.

[9]Aruguete D M，Kim B，Jr H M，et al. Antimicrobial nanotechnology：its potential for the effective management of microbial drug resistance and implications for research needs in microbial nanotoxicology[J]. Environmental Science Processes & Impacts，2013，15（1）：93-102.

[10]張 紅，程寒飛. 水環境中氨基糖苷類抗性基因污染及研究進展[J]. 環境科學與技術，2018，41（10）：121-130.

[11]Heuer H，Krgerrecklenfort E，Wellington E M H，et al.[J]. Fems Microbiology Ecology，2002，42（2）：289-302.

[12]Hsu C Y，Hsu B M，Ji W T，et al. A potential association between antibiotic abuse and existence of related resistance genes in different aquatic environments[J]. Water Air & Soil Pollution，2015，226（1）：2235.

[13]鹽酸萬古霉素臨床應用劑量專家組. 鹽酸萬古霉素臨床應用劑量中國專家共識[J]. 中華傳染病雜志，2012，30（11）：641-646.

[14]何方洋，羅曉琴，張 禹，等. 牛奶中鹽酸萬古霉素殘留的膠體金免疫層析法測定試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2013（15）：82-193.

[15]Fridkin S K，Hageman J，McDougal L K，et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin，United States，1997-2001[J]. Clinical Infectious Diseases，2003，36（4）：429-439.

[16]柳林整. 氨基糖苷類抗生素耳毒性機制的研究進展[J]. 青島醫藥衛生，2003（3）：221-223.

[17]Cross L M，Cook M A，Lin S，et al. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology，2003，23（5）：911-912.

[18]孫智慧，賈順姬，孟安明. 斑馬魚：在生命科學中暢游[J]. 生命科學，2006，18（5）：431-436.

[19]Guiney P D，Walker M K，Spitsbergen J M，et al. Hemodynamic dysfunction and cytochrome P4501A mRNA expression induced by 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin during embryonic stages of lake trout development[J]. Toxicology and Applied Pharmacology，2000，168（1）：1-14.

[20]Ohlsen K，Ternes T，Werner G，et al. Impact of antibiotics on conjugational resistance gene transfer in Staphylococcus aureus in sewage[J]. Environmental Microbiology，2003，5（8）：711-716.