急性腦缺血再灌注大鼠NMDA受體NR2A/B表達的變化及其作用機制分析

呂文龍，湯淑秀，趙玉

1江蘇聯合職業技術學院連云港中醫藥分院，江蘇連云港 222007；2.徐州醫科大學人體解剖學與神經生物學教研室，江蘇徐州 221002

NMDA受體屬于為興奮性氨基酸-谷氨酸離子型,亞單位為NR1和NR2兩種組成。NMDA受體參與體內神經的發育、學習記憶、血管性癡呆等多項生理活動[1]。目前對腦組織NMDA受體亞單位研究的主要部位是在海馬、皮質區，紋狀體是大腦中動脈缺血再灌注時的主要受損腦區之一[2]。該研究2016年8月—2017年9月選取60只雄性Wistar大鼠，主要探討急性腦缺血再灌注大鼠NMDA受體NR2A/B表達的變化及其作用機制分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院動物實驗室飼養60只雄性Wistar大鼠，按隨機數字表法將所有大鼠分為對照組和假手術組、腦缺血再灌注3組。所有大鼠均給予充足的水分與食物，生活的環境均為25℃。納入標準：大鼠均由徐州醫科大學實驗室動物中心提供。排除標準：大鼠的心肺功能不全，肺、肝、腎等器官具有重大疾病。兩組大鼠的一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性，該研究通過醫學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 對照組處理 對照組大鼠進行正常的飼養，不做處理。假手術組大鼠進行假手術。

1.2.2 頸動脈引流法 腦缺血再灌注組大鼠進行頸動脈引流法全腦缺血再灌注造模，首先對大鼠進行麻醉，采用腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）,右股靜脈與雙側頸總動脈進行分離。1%肝素（1.5 mL/kg）經右股靜脈注射大鼠體內，并作插管備用,將右頸總動脈進行結扎，備用管插入點經右頸總動脈結扎點遠心端，左側頸總動脈進行夾閉，使右頸總動脈血經插管向右股靜脈分流，7 min后撤除插管，進行結扎止血，松開左頸總動脈，進行復灌[3]。假手術組大鼠的不同在于，對大鼠進行麻醉后，將血管分離，注入肝素，不做插管。

1.2.3 觀察分析 分別于不同的時間段開胸，對左心室進行沖洗與灌注固定，試劑選擇為4℃生理鹽水（200 mL/只）、4℃ 4%多聚甲醛（500 mL/只，ph=7.4），灌畢取腦，溫度為4℃狀態下固定，過夜，25%蔗糖溶液、4℃沉底。切取的部位為視交叉至乳頭體后部平面腦段，切片放于恒冷箱冰凍，切片厚度為40 μm，對切片進行免疫細胞化學反應，按ABC法分步進行實驗。采用的試劑為:兔抗鼠NR2A/B（Chemicon 公司，效價 1:1 000），生物素化羊抗兔 IgG（Sigma公司，效價 1:500），ABC 復合物（Sigma 公司，效價 1:500）[4]。陰性對照中采用抗體稀釋液替代一抗，進行常規貼片、脫水、透明、封片、鏡檢等操作。采用HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統，對3組大鼠的腦切片進行圖像分析[5]。

1.3 觀察指標

記錄各組大鼠紋狀體中NR2A陽細胞數、平均灰度、平均光密度，以及不同時間段頂皮質區NR2A、NR2B免疫陽性面積。

1.4 統計方法

數據應用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，其中計量資料用（±s）表示進行 t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠紋狀體中各項指標的對比

對照組大鼠的NR2A陽細胞數、平均灰度、平均光密度優于假手術組、腦出血再灌注組（P＜0.05），具體見表1。

表1 3組大鼠紋狀體中各項指標的對比（±s）

表1 3組大鼠紋狀體中各項指標的對比（±s）

組別 例數 陽細胞數 平均灰度 平均光密度對照組假手術組腦出血再灌注組20 20 20 t值 P值56.3±7.8 96.2±2.5 74.3±12.4 12.394＜0.05 147.8±6.3 113.5±11.3 134.4±6.8 13.391＜0.05 0.34±0.03 0.43±0.02 0.28±0.02 11.125＜0.05

2.2 不同時間段頂皮質區NR2A、NR2B免疫陽性面積對比

對比不同時間段頂皮質區NR2A、NR2B免疫陽性面積，腦出血再灌注組大鼠NR2A、NR2B免疫陽性面積6 h后高于對照組、假手術組大鼠 （P＜0.05），假手術組6 h后免疫陽性面積高于正常對照組（P＜0.05）,具體見表 2。

表2 不同時間段頂皮質區NR2A、NR2B免疫陽性面積對比（±s）

表2 不同時間段頂皮質區NR2A、NR2B免疫陽性面積對比（±s）

組別 6 h 24 h 72 h對照組（n=20）假手術組（n=20）腦出血再灌注組（n=20）t值 P值4676.4±143.6 5736.4±124.7 7783.4±231.4 14.684＜0.05 4676.4±143.6 4946.4±163.7 4552.4±154.2 12.316＜0.05 4676.4±143.6 4673.6±132.6 4524.5±153.4 0.942＞0.05

3 討論

近年來，隨著醫療水平的進步大部分組織器官缺血后可以重新進行血液再灌注。組織器官進行缺血后再灌注功能可以恢復，損傷結構可以修復[6]。缺血后再灌注可能導致加重組織、器官的功能障礙與結構損傷，發生不可逆性損傷，稱為缺血再灌注損傷。

NMDA受體屬于鈣離子通道，是由功能亞單位NR1和調節亞單位NR2A～NR2D組成的,區域特征為主要的中樞分布[7]。腦缺血再灌注時，海馬不同區域NMDA受體的NR2B、NR2A等表達存在差異。腦缺血再灌注不同時間段，對皮質神經元NMDA受體亞單位的表達，產生不同的影響。該研究中，對照組大鼠的陽細胞數、平均灰度、平均光密度分別為（56.3±7.8）、（147.8±6.3）、（0.34±0.03），假手術組大鼠的陽細胞數、平均灰度、平均光密度分別為（96.2±2.5）、（113.5±11.3）、（0.43±0.02）腦出血再灌注組的陽細胞數、平均灰度、平均光密度分別為（74.3±12.4）、（134.4±6.8）、（0.28±0.02）。對照組大鼠的NR2A陽細胞數、平均灰度、平均光密度優于假手術組、腦出血再灌注組（P＜0.05），此結果與有關報道一致。近年的研究表明,在腦缺血再灌注不同時間段,海馬不同區域NMDA受體亞單位表達存在明顯差異,其NR2A、NR2B蛋白表達的規律與該研究結果一致。

腦缺血缺氧是由各種原因引起的,但大腦局部受損組織的神經元釋放大量的興奮性氨基酸 （EAA）。EAA重攝取大幅度降低，死亡細胞產生大量EAA。因此認為在缺血性腦損傷中，NMDA受體起到重要作用，調控該受體通道被認為是目前治療缺血性腦病中的方式之一[8]。有關研究表明，對NMDA受體的活性進行抑制，可以減少鈣內流，阻止發生NMDA受體介導的缺血性腦損傷[9-10]。相關研究報道NR1主要標記大鼠皮質錐體細胞胞體及其較粗的樹突顆粒細胞談染,NR2A/NR2B的表達模式與NRI相似,3個亞單位的蛋白質表達與其mRNA的表達相吻合的。該研究中，腦出血再灌注組大鼠NR2A、NR2B免疫陽性面積6 h后高于對照組、假手術組大鼠 （P＜0.05），假手術組6 h后免疫陽性面積高于正常組 （P＜0.05），72 h 3組大鼠免疫陽性面積差異無統計學意義（P＞0.05）。

綜上所述，腦缺血再灌注可以導致NR2B、NR2A蛋白表達產生變化，調節NMDA受體的整體功能活性，減輕腦缺血再灌注引起的局灶性腦損傷，對腦神經起到保護作用。