清肝益腎袪風復方干預高血壓腸道屏障功能失調的效應機制研究＊

熊敏琪，唐曉婷，崔金剛，丁李立強，唐新淼，王培偉，陳 瑜＊＊，張 騰＊＊

（1. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院 上海 200437；2. 上海市中醫藥研究院中西醫結合臨床研究所 上海 200437）

高血壓是冠心病發病和死亡的主要危險因素，也是腦卒中的高危因素，占世界范圍內主要死亡疾病譜的主導地位。近年來圍繞高血壓發病和防治的研究不斷呈現新的成果，腸道屏障及其功能等研究為諸多復雜性疾病發生機制的認識產生了巨大影響，也為高血壓發生機制和防治研究開啟了新的窗口。研究表明，腸道屏障穩態變化與心血管疾病的轉歸有著密切關聯性[1]，且本課題組前期研究表明清肝益腎祛風復方具有顯著的降壓效果[2]，因此本實驗旨在探索清肝益腎祛風復方的降壓效應是否與調節腸道屏障功能相關，為其臨床推廣應用提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.2 藥物與試劑

WKY 大鼠18 只，SHR 大鼠54 只，雄性，4 周齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

QYQ 購于上海康橋中藥飲片有限公司。坎地沙坦酯片（8 mg）：國藥準字J20150085，日本武田藥品工業株式會社。異硫氰酸熒光素標記葡聚糖（FITCdextran，FD4）購自美國Sigma 公司。逆轉錄試劑盒購于寶生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

實時熒光定量PCR 系統：Roche 公司；冰凍切片機：Leica 公司；正置顯微鏡：Leica 公司；熒光分光光度計：Bio-Tek公司。

1.4 動物分組及給藥

所有實驗動物用普通飼料適應性喂養1 周后，將SHR 大鼠隨機分為模型組、清肝益腎袪風復方組（QYQ）、坎地沙坦酯片組（Can），以同周齡WKY 雄性大鼠為正常對照組，每組18只。QYQ 組（川芎15 g、柴胡15 g、黃連6 g、羌活15 g、防風15 g、夏枯草30 g、川牛膝15 g、黃精15 g、石決明20 g、炒黃芩15 g、桑寄生15 g、益母草30 g）各藥材采用中藥常規煎煮法，按照人體劑量6.3 倍換算后濃縮灌胃；坎地沙坦酯片用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，按照人體劑量換算以1 mg·kg-1的劑量灌胃，給藥體積2 mL，每日1 次；空白對照組和模型組給予等體積飲用水。每組大鼠在4周齡時開始灌胃，取6只持續給藥至8周齡，6只持續給藥至12周齡，6只持續給藥至20周齡。

1.5 腸道滲透性檢測

將12 周齡和20 周齡的實驗動物禁食12 h，次日給各組大鼠稱重，將FITC-dextran 溶解于PBS 中，用44 mg/100 g 的濃度給大鼠灌胃，4 小時后眼眶內眥靜脈采血，分離血清，4℃避光保存，用熒光分光光度計(激發波長485 nm、發射波長528 nm)測量血清吸光度值。

1.6 動物處理及組織形態學檢測

實驗動物分別于8 周齡、12 周齡及20 周齡時取材，小心將遠端回腸和近端結腸取出，分別縱向剖開，一分為二，一份放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進行H&E 染色和Masson's trichrome 染色觀察病理形態學的改變，利用Image Pro Plus 6.0軟件進行定量分析；一份液氮速凍，用于總RNA抽提。

1.7 基因表達檢測

將液氮速凍的回腸和結腸組織進行RNA 抽提，隨后用PCR 定量測試儀進行逆轉錄，再用RT-PCR 法檢測各基因的表達，以GAPDH 為內參。引物序列見表1。

表1 引物列表

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件分析。實驗數據以均數±標準差表示，若符合正態分布和方差齊性，多組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，兩兩比較采用SNK 檢驗，對有序分類資料進行Ridit 分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 清肝益腎袪風復方顯著降低20 周齡SHR 大鼠腸道滲透性

如圖1 所示，12 周齡時，與WKY 組相比，模型組SHR 大鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）。與SHR 模型組相比，Can 組與QYQ 治療組大鼠血清FITC-dextran濃度有降低趨勢，但無統計學差異。

20周齡時，與WKY 組相比，模型組SHR 大鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）；與模型組SHR大鼠相比，Can 組大鼠血清FITC-dextran 濃度無明顯差異；QYQ 治療組血清FITC-dextran 濃度顯著降低（P＜0.05）。QYQ 治療組與Can 組相比，血清FITCdextran濃度顯著降低（P＜0.05）。

圖1 QYQ顯著降低20周齡SHR大鼠腸道滲透性

2.2 清肝益腎袪風復方顯著改善SHR 大鼠回腸及結腸病理損傷

根據回腸及結腸損傷受累面積、損傷程度等，分別標記－、±、++、+++、++++，其中－代表無明顯損傷，++++為存在極重度損傷。

如圖2 所示，8 周齡WKY 組，SHR 模型組，Can 組及QYQ 治療組回腸結構完整，未見明顯病理性改變。12 周齡WKY 組回腸結構完整，SHR 模型組回腸壁絨毛壞死，Can組回腸壁粘膜表面局部糜爛，QYQ治療組未見明顯異常。與WKY 組比較，SHR 模型組回腸組織病理損傷評分高于WKY 組，無統計學差異；與SHR模型組比較，Can 組及QYQ 治療組回腸組織病理損傷評分低于SHR 模型組，無統計學差異（表2A）。20 周齡回腸，WKY組回腸結構完整，未見明顯病理性改變，SHR 模型組回腸壁局部粘膜上皮壞死脫落糜爛形成，Can 組回腸粘膜較大面積淺潰瘍形成，粘膜層顯著充血水腫、炎細胞浸潤，QYQ 治療組偶見微小粘膜表面糜爛。與WKY 組比較，SHR 模型組回腸組織病理損傷評分高于WKY 組（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，Can 組與QYQ 治療組回腸組織病理損傷評分均顯著降低（P＜0.05）（表2B）。

表2 A 12周齡各組大鼠回腸損傷評分

表2B 20周齡各組大鼠回腸損傷評分

表2 C 12周齡各組大鼠結腸損傷評分

表2D 20周齡各組大鼠結腸損傷評分

8 周齡結腸WKY 組，SHR 模型組，Can 組及QYQ治療組結腸結構完整，未見明顯病理性改變；12 周齡結腸，WKY 組結腸結構完整，SHR 模型組結腸壁粘膜層表面糜爛，Can 組結腸壁粘膜層及粘膜下層輕度水腫，QYQ 治療組結腸結構完整；與WKY 組比較，SHR模型組結腸組織病理損傷評分顯著高于WKY 組（P＜0.05），與SHR 模型組比較，Can 組及QYQ 組結腸組織病理損傷評分無明顯差異（表2C）。20 周齡結腸，WKY 組結腸結構完整，未見明顯病理性改變，SHR 模型組結腸壁粘膜表面糜爛，滲出壞死組織覆蓋，Can組結腸壁多發粘膜表面糜爛、充血水腫，QYQ 結腸壁小潰瘍形成，潰瘍周邊上皮細胞和纖維組織增生修復。與WKY 組比較，SHR 模型組結腸組織病理損傷評分顯著升高（P＜0.05），與SHR 模型組比較，QYQ 治療組結腸組織病理損傷評分顯著降低（P＜0.05），SHR 模型組與Can組比較無明顯差異（表2D）。

圖2 不同周齡大鼠回腸、結腸H&E染色（×200）

2.3 清肝益腎袪風復方顯著抑制20 周齡SHR 大鼠回腸及結腸組織纖維化形成

與8 周齡、12 周齡及20 周齡WKY 大鼠回腸和結腸組織纖維化相對面積比較，SHR 模型組纖維化相對面積顯著升高，有統計學差異（P＜0.05）。在8周齡及12 周齡，與SHR 模型組相比，Can 組及QYQ 治療組回腸及結腸纖維化相對面積無明顯差異；20 周齡，與SHR 模型組纖維化相對面積比較，QYQ 治療組回腸及結腸纖維化面積顯著降低，有統計學差異（P＜0.05），且QYQ 治療組結腸纖維化面積顯著低于Can 組，有統計學差異（P＜0.05）（圖3）。

2.4 清肝益腎袪風復方顯著升高20 周齡SHR 大鼠回腸、結腸緊密連接蛋白表達

如圖4A 所示，與WKY 組相比，8 周齡SHR 模型組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達無明顯差異；與SHR模型組比較，Can組回腸Cgn，Tjp1 mRNA表達無差異，Ocln mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組回腸Cgn mRNA 表達顯著升高（P＜0.05），Tjp1 mRNA 表達無明顯差異；與SHR 模型組比較QYQ 治療組回腸Ocln mRNA 表達無明顯差異，與Can 組比較表達水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 不同周齡大鼠腸道Masson's trichrome染色（×400）

圖4 不同周齡大鼠腸道緊密連接蛋白mRNA表達

如圖4B 所示，與WKY 組相比，20 周齡時SHR 模型組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 和Tjp1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組相比，Can 組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達無差異，Tjp1 mRNA 表達顯著升高（P＜0.05）；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達顯著升高（P＜0.05），Tjp1 mRNA表達與模型組比顯著升高（P＜0.05）。

如圖4C 所示，與WKY 組相比，8 周齡SHR 模型組大鼠近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，Can 組大鼠近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 及Tjp1 mRNA 表達無差異；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 及Tjp1 mRNA 表達無差異。

如圖4D 所示，與WKY 組相比，20 周齡時SHR 模型組大鼠近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 和Tjp1 mRNA 顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組相比，Can組大鼠近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達無差異，Tjp1 mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）；與SHR模型組及Can 組比較，QYQ 治療組近端結腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln及Tjp1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

腸道是人體最大的免疫器官，腸粘膜上皮由單層細胞組成，對維持腸道穩態起著至關重要的作用，既作為物理屏障，又作為免疫防御屏障[3]。腸道屏障功能受損與許多疾病狀態有關，包括腸道和全身。由于屏障功能障礙引起的腸通透性增加可能導致微生物移位[4]。可能引起各種疾病的低度炎癥[5]。

FITC-dextran 是反映腸道對大分子物質滲透性的指標，用來評估腸上皮組織的緊密連接損傷。本課題組通過檢測血清FITC-dextran 濃度發現，相比WKY 組大鼠，SHR 模型組大鼠腸道滲透性顯著升高，QYQ 具有顯著干預高血壓相關腸道滲透性的改變。同時本課題組研究發現與20 周齡WKY 組相比，SHR 模型組回腸結腸粘膜表面糜爛明顯，組織病理損傷評分顯著升高及纖維化相對面積顯著升高（P＜0.05）。而QYQ治療組回腸結腸組織病理損傷評分顯著降低（P＜0.05），腸道炎癥情況顯著改善，同時20周齡QYQ 治療組回腸及結腸纖維化面積與SHR 模型組比較顯著降低（P＜0.05），提示QYQ 對高血壓相關回腸及結腸組織損傷具有顯著的干預效應。

緊密連接（Tight junctions，TJS）是上皮細胞和內皮細胞發揮生理功能的基本結構[6]。腸道上皮細胞通過緊密連接等結構形成屏障，維持人體健康[7]。在正常腸上皮組織中，扣帶蛋白（Cingulin，Cgn）和閉合蛋白（Occludin，Ocln）等緊密連接蛋白構成緊密連接，對維持上皮結構和功能的完整及細胞的生長，代謝起重要作用[8]。緊密連接相關蛋白表達的改變，緊密連接中斷，是腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加的一個關鍵因素[9]，調節上皮緊密連接蛋白可加強上皮屏障功能的恢復[7,10]。

腸道物理屏障由腸上皮細胞及細胞間的連接組成，以Cgn、Ocln 及 緊密 連 接 蛋 白1（Tight junction protein1，Tjp1）為代表的緊密連接蛋白是腸道物理屏障的重要組成部分，腸屏障功能破壞，其結果將導致腸道內的細菌及毒素入血，加重全身炎癥反應。通過調節緊密蛋白的表達和定位來調節上皮細胞的屏障功能是治療一些疾病的一個潛在的新靶點[11]。

本課題組分析了不同周齡大鼠及藥物干預后腸緊密連接蛋白mRNA 的表達變化。結果發現，相比WKY 大鼠，20 周齡SHR 模型組大鼠的回腸及結腸的相關緊密連接蛋白mRNA 表達顯著降低，本研究結果與文獻報道一致[12]。經QYQ 治療可以顯著增加20 周齡SHR 大鼠腸緊密連接蛋白Cgn、Ocln 及Tjp1 mRNA表達水平。

綜上所述，清肝益腎祛風復方對高血壓相關腸道屏障功能失調的干預效應可能與其調節腸道緊密連接蛋白的表達水平有關。