基于PEG-PLGA和CMCS載體制備白藜蘆醇納米粒在結腸癌治療中的應用＊

王耀文，張雪瓊，馬靜靜，湯明秀，李佳明，邱 彤＊＊

（1. 武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070；2. 武漢大學人民醫院胃腸科 武漢 430060；3. 武漢理工大學生物醫學材料與工程中心 武漢 430070）

結直腸癌（CRC）作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，已成為世界上第二大癌癥相關死亡原因[1,2]。目前，化療是結直腸癌最常見的治療方法之一，奧沙利鉑聯合5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣（5-FU/LV）作為晚期CRC 的標準一線化療藥物，已廣泛應用于結腸癌臨床治療[3,4]。然而，長期使用化療藥物會引起一系列的副作用，如耐藥性、神經毒性、骨髓抑制和肝毒性等[5]。因此，一些低毒高效的天然化合物逐漸成為結腸癌治療的研究熱點[6]。白藜蘆醇（RES）是從葡萄、漿果、花生和紅酒中提取的一種天然多酚化合物，由于其抗氧化、抗衰老、抗腫瘤活性以及心血管和神經保護作用，近年來引起了人們的廣泛關注[7-9]。已有研究證明RES 預防結腸癌發生的能力與抑制腫瘤細胞周期和誘導結腸癌細胞死亡有關[10,11]。Jeong 等研究者發現RES 可通過分子靶點TCF4 誘導結直腸癌細胞凋亡[12]。DeMoulin 表明RES 可通過調整拓撲異構酶II 誘導結腸癌細胞DNA 損傷[13]。然而，由于RES 的溶解性差、生物利用度低、代謝快、光敏性差等缺點，其在體內外都難以發揮良好的生物活性[14]。納米給藥系統（NDDs）在提高親脂性藥物生物利用度方面具有巨大的潛力[15-17]。越來越多的載體被廣泛地應用于控釋或靶向給藥系統，包括可溶性聚合物、脂質體、微球和納米粒子（NPs）。NPs 可以攜帶藥物在其內部或附著在其表面，從而實現被動或主動靶向給藥。NPs 通過增強滲透和滯留（EPR）效應在腫瘤部位有效累積，延長藥物在體內的半衰期[18]。聚乙丙交酯聚乙二醇共聚物（PEG-PLGA）共聚物作為藥物載體，可保護藥物的降解，并實現藥物的緩釋[19-21]。同時，羧甲基殼聚糖（CMCS））以其優異的水溶性、良好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等優點，也被廣泛應用于納米粒子的研究中[22-24]。

目前，RES 納米粒在結腸癌治療中的研究相對較少，本研究采用納米沉淀法和乳化交聯法分別制備了RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 納米粒子[25,26]，并進行了一系列表征。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器

白藜蘆醇（上海阿拉丁試劑有限公司），羧甲基殼聚糖（CMCS）（M=1×104，DD=85%，青島弘海生物技術有限公司）；聚乙丙交酯聚乙二醇共聚物（PEGPLGA）（濟南岱罡生物工程有限公司）；尼羅紅（源葉生物技術科技有限公司）；人結腸腺癌細胞（SW480 細胞）（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；CCK-8 試劑盒、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Leibovitz's L-15 培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素（100 IU·mL-1）、鏈霉素（100 IU·mL-1）和胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司）。

紫外分光光度計UV-2600（香港島津有限公司）；Zetasizer 納米粒度分析儀Nano-ZS90（Malvern）；冷凍干燥機FD-1A-50（北京博醫康實驗儀器有限公司）；恒溫震蕩箱KDC-ZS90（力康發展有限公司）；酶標儀Multiskan GO-1510（Thermo-Scientific）；細胞培養箱HF90（力康發展有限公司）；激光共聚焦顯微鏡LabRAM HR800（Horiba Jobin Yvon）

1.2 納米粒的制備

1.2.1 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的制備

采用納米沉淀法制備RES-PEG-PLGA NPs。將40 mg PEG-PLGA 和5 mg RES 溶解在300 μL 丙酮中，室溫攪拌下，將丙酮溶液緩慢滴加到4 mL 去離子水中，得到乳狀膠體懸浮液，在室溫下攪拌過夜，待丙酮完全揮發。將反應液以5 000 rpm 轉速，離心30 min，除去大顆粒。最后，在16 000 rpm 轉速，4℃條件下離心1 h，沉淀用去離子水洗滌3 次。將沉淀層重懸，冷凍干燥，供進一步使用。

采用乳化交聯法制備RES-CMCS NPs。用0.3%吐溫溶液配2 mg·mL-1CMCS 溶液，過濾去除溶液中的雜質。將5 mg RES溶解在0.2 mL三氯甲烷中，緩慢滴入10 mL CMCS 溶液中，超聲乳化10 min，得到初乳。磁力攪拌下將適量0.5 wt%CaCl2溶液逐滴滴加至乳液中，35℃溫度條件下，磁力攪拌過夜至三氯甲烷完全揮發。在轉速6 000 rpm，離心30 min，去除大顆粒和未包封的RES。最后，將納米粒懸浮液在4℃，16 000 rpm條件下離心1 h。沉淀用去離子水洗滌3 次。將沉淀層重懸，冷凍干燥。

同時，按照上述方法制備未載藥納米粒PEGPLGA NPs 以及CMCS-NPs，作為空白納米粒，并冷凍干燥，供進一步使用。

1.2.2 Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs的制備

用尼羅紅（Nile red）作為熒光探針標記納米粒。將50 μL 尼羅紅丙酮溶液（1 mg·mL-1）加入含40 mg PLGA-PEG和5 mg RES的300 μL丙酮溶液中。然后，采用上述納米粒沉淀法制備Nile red-RES-PEGPLGA NPs。將120 uL 1 mg·mL-1尼羅紅溶液（三氯甲烷為溶劑）滴加入已溶解5 mg RES 的0.2 mL 三氯甲烷中，混勻，將有機溶液緩慢滴入CMCS 溶液中，超聲乳化10 min，得到初乳。磁力攪拌下將適量0.5 wt%CaCl2溶液逐滴滴加乳液中，35℃磁力攪拌過夜至三氯甲烷完全揮發。溶液以6 000 rpm 離心30 min，去除大顆粒和未包封的RES。最后，將納米粒懸浮液以16 000 rpm轉速，在4℃條件下離心1 h。沉淀用去離子水洗滌3 次，得到Nile red-RES-CMCS NPs。將Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 懸浮液冷凍干燥，供進一步使用。

2 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的表征

2.1 粒徑、zeta電位的測定

粒徑和Zeta 電位通過動態光散射法（DLS）測量。待測試納米粒子水溶液濃度為1 mg·mL-1，設置散射角為90°，測試溫度為25℃，每個樣品重復測試3次。

2.2 形態觀察

將1滴納米?；鞈乙海? mg·mL-1）滴在200目的銅網上，室溫下自然干燥后在透射電鏡（TEM）下觀察。

2.3 包封效率（EE）和載藥量（DL）的測定

用紫外可見光譜法測定了納米粒子的包封率和載藥量。將1 mg RES-PEG-PLGA NPs 粉末溶于1 mL DMF 中，對有機溶液定量稀釋，進行含量測定。另外，

表1 平均粒徑（PS）、多分散系數（PDI）和Zeta電位（n=3，±s）

表1 平均粒徑（PS）、多分散系數（PDI）和Zeta電位（n=3，±s）

Batch RES-PEG-PLG NPs RES-CMCS NPs PEG-PLGA NPs CMCS NPs PS/nm±SD 78.67±1.0 231.5±1.6 70.40±0.98 229.9±1.4 PDI±SD 0.15±0.01 0.09±0.01 0.16±0.01 0.10±0.01 Zata/mV±SD-5.86±0.95-14.4±0.5-4.31±0.85-13.2±0.5

1.2.1 中攪拌過夜的10 mL RES-CMCS NPs 溶液在6 000 rpm 轉速、4℃下離心30 min，沉淀用去離子水沖洗兩次。沉淀用DMF 完全溶解，定量稀釋，在306 nm處用紫外可見光譜法對上述兩種稀釋溶液進行分析，并參照校準曲線（標準溶液范圍為2-20 μg/mL，R2=0.9992）計 算。 EE% 和DL% 按下列公式計算，（1）和（2）：

2.4 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 體外釋藥研究

采用動態透析法測定兩種納米粒以及游離RES（free RES）的體外釋藥情況。制備了兩種不同pH（pH7.4 和pH5.8）的磷酸緩沖液（PBS）作為釋放介質，精確稱取RES 原藥以及納米粒子凍干粉，分別溶解于5 mL 緩沖液中，裝入透析袋（MWCO3500），扎緊后置于50 mL PBS 中，在（37±0.5）℃、100 r·min-1條件下恒溫振蕩，定時取樣，并立即補加相同量的釋藥介質。樣品過濾后用紫外可見光譜法測定白藜蘆醇的含量，計算累積釋放量。

2.5 體外抗腫瘤活性研究

以SW480結腸癌細胞為研究對象，運用CCK-8檢測法考察納米粒子對結腸癌細胞的抗增殖活性，從而評價其體外抗腫瘤的作用。取對數生長期的SW480細胞，用PBS 洗滌兩遍以后，經胰蛋白酶消化，離心后在細胞培養液中重懸。將SW480 細胞懸液接種于96孔（5 000個細胞/孔）培養板中，于37℃，5%CO2細胞培養箱內孵育24 h，使細胞貼壁。每孔分別用不同濃度（0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1的RES）RES-PEGPLGA NPs 和RES-CMCS NPs 孵育24 h 和48 h。同時用不同濃度（0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1的藥物載體）的空白納米粒子PEG-PLGA NPs 和CMCS NPs 孵育24 h、48 h。每個濃度設置6 個復孔。培養24 h 和48 h后，棄去培養液，用無血清培養基洗滌3次。每孔加入100 μL 培養液（10%CCK-8，90%培養液），繼續孵育4 h，用酶標儀于450 nm 波長處測定光密度值（OD），細胞活力可根據下列公式計算，（3）：

2.6 體外細胞攝取研究

用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）研究了納米粒子在SW480 細胞中的攝取。將SW480 細胞分別接種于共聚焦培養皿中（1 × 106個細胞/孔），用2 mL 培養液孵育24 h。棄去培養液，加入分別含Nile red-RESPEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 的 培養 液2 mL（Nile red濃度為5 μg·mL-1），于37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育0.5、1、2 和4 h。在規定時間間隔內，棄去培養液，用PBS 洗滌3 次。用4%甲醛固定20 min后，用PBS 洗滌3 次。隨后，用適量的DAPI 處理細胞15 min，用PBS 洗滌3 次。用CLSM 技術觀察細胞熒光圖像。

3 結果和討論

3.1 平均粒徑（PS）、多分散系數（PDI）和Zeta電位

RES-PEG-PLGA NPs 的 平均 粒 徑為78.67 ± 1.0 nm，PDI 為0.15 ± 0.01。RES-CMCS NPs 的平均粒徑為231.5±1.6 nm，PDI為0.09±0.01（表1）。兩種納米粒子分散體系均為典型的單分散體系，在圖1 中呈單峰分布。RES-PEG-PLGA NPs 的粒徑明顯小于RESCMCS NPs，這可能是由于PEG-PLGA 兩親性共聚物能夠在水中自組裝形成粒徑較小的膠束納米粒子[27]。

3.2 形態觀察

圖3 為RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的TEM 圖，均呈圓形或者類圓形，透射電鏡下，RESPEG-PLGA NPs 粒徑約為60 nm，RES-CMCS NPs 粒徑約為180 nm。兩者均小于DLS 法測得的平均粒徑。可能是因為TEM 法是在干燥狀態下測定粒徑，而DLS法是在水溶液中測定，會受到溶脹效應的影響。

3.3 包封效率（EE）和載藥量（DL）的測定

依據2.3 方法測定RES-PEG-PLGA NPs 和RESCMCS NPs 的包封效率（EE）和載藥量（DL），結果如表2所示，

圖1 粒徑分布（A）Res-PEG-PLGA NPs和（B）Res-CMCS NPs

圖3 RES在306 nm處的標定曲線

圖4 體外藥物釋藥曲線

表2 包封效率（EE）和載藥量（DL）

3.4 體外釋藥研究

圖5 為RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs在兩種不同釋藥介質中的累積釋放曲線。根據圖4的校準曲線計算，在2 h，游離RES 的累積釋放量達到了約55%，RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 的釋放量分別約為15%和34%。在4h，游離Res 釋放量達到了70%，RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 的釋放量分別是32%和40%，結果表明兩種納米粒均具有一定的緩釋作用，能顯著延長RES 的釋藥時間，從而達到提高RES生物利用度的目的。

圖5 不同濃度（0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1）游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs、CMCS NPs、PEG-PLGA NPs對SW480細胞活力的影響。將S W480細胞孵育24 h，用CCK-8法測定細胞活力。

圖6 不同濃度（0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1）free RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs、CMCS NPs、PEG-PLGA NPs對SW480細胞活力的影響。將SW480細胞孵育48 h，用CCK-8法測定細胞活力

表3 RES-PEG-PLGA NPs和RES-CMCS NPs對SW480細胞的IC50值

3.5 體外細胞毒性

采用CCK-8法檢測空白納米粒子，游離RES 以及載藥納米粒子對SW480細胞體外細胞毒性。如圖5和圖6 所示，不同濃度的空白納米粒PEG-PLGA NPs，CMCS NPs 對SW480 細胞幾乎無毒性，該結果表明，CMCS 和PEG-PLGA 具有良好的生物相容性，可以用作理想的藥物載體。當20 μg·mL-1游離RES、RESCMCS NPs和RES-PEG-PLGA NPs分別與SW480細胞孵育24 h 后，細胞存活率分別為61.84%、57.36%和8.73%。當濃度增加到40 μg·mL-1時，RES-CMCS NPs和RES-PEG-PLGA NPs 的細胞存活率分別下降到16.25%和6.13%。與游離藥物相比較，RES-CMCS NPs 和RES-PEG-PLGA NPS對SW480 細胞表現出較高的細胞增殖抑制作用，并且對腫瘤細胞的抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。同時，這些結果也表明，相 比RES-CMCS NPs，RES-PEG-PLGA NPS對SW480 細胞表現出更高的細胞毒性。這可能是由于納米粒徑大小之間的顯著差異，RES-PEG-PLGA NPs粒徑為78.67 ± 1.0 nm，與RES-CMCS NP（S231.5 ± 1.6 nm）相比，更易于被細胞攝??；另一方面，帶有表面負電荷的CMCS與攜帶負電荷的腫瘤細胞膜之間的排斥作用可能導致納米粒子在細胞內的攝取減少。

半數抑制濃度（IC50）計算結果如表3 所示，與SW480 細胞孵育24 h，游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PL GANPs的IC50值分別為24.03 μg·mL-1、20.83 μg·mL-1和7.51μg·mL-1；孵育48 h 后，游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs 對 應 的IC50值為20.81 μg·mL-1，3.27 μg·mL-1和1.47 μg·mL-1。結果表明，與游離RES 相比，RES-PEG-PLGA NPS和RES-CMCS NPS提高了RES 對結腸癌細胞的殺傷效率。

3.6 體外細胞攝取研究

用CLSM 研 究Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 分別與SW480 細胞孵育0.5、1、2、3 和4 h 后的細胞攝取。細胞核經DAPI 染色后呈藍色熒光，熒光素尼羅紅呈紅色熒光。如圖7 和圖8所示，孵育0.5 h 和1 h 后，Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 組中細胞胞質和細胞核周圍呈現微弱的紅色熒光，繼續培養2h 后，紅色熒光明顯增強。當孵育4 h 后，Nile red-RES-PEGPLGA NPs 組細胞核內的熒光強度明顯高于Nile red-RES-CMCS NPs 組。原因可能是與Nile red-RESCMCS NPs 相比，粒徑較小的Nile red-RES-PEGPLGA NPs 更容易被SW 480 細胞攝取；同時，Nile red-RES-CMCS NPs表面的負電荷可能通過排斥作用阻礙納米粒在細胞中的攝取。這個結果與上述3.5 細胞毒性結果是一致的。圖7 和圖8 結果表明，這兩種納米藥物給藥系統在SW480 細胞中均可以有效內化并持續保留。

圖7 RES-CMCS NPs的體外細胞攝取

圖8 RES-PEG-PLGA NPs的體外細胞攝取

4 總結

報道表明，用傳統的化學療法治療惡性腫瘤時，小分子藥物很容易被腎清除并在體內呈現非特異性分布，這樣抗腫瘤藥物就很難到達腫瘤部位；為了達到治療濃度，抗腫瘤藥物濃度被提高，這相應也會帶來一系列的臨床毒副作用[28]?？紤]到以上情況，本文以生物相容性良好的CMCS 和PEG-PLGA 作為載體，成功制備了RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs。綜合實驗結果表明，兩種納米給藥系統RES-PEGPLGA NPs 和RES-CMCS NPs 對RES 均表現出較高的載藥能力，分別為87%和60%。同時RES-PEG-PLGA NPs 表現出良好的平均水動力直徑78.67±1.0 nm，可在實體腫瘤中被動聚集，通過增強通透性及滯留效應（EPR）增強藥物的細胞毒性。與游離RES 相比，RESPEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 具有明顯的緩釋作用，同時可被SW480 細胞有效內化并抑制細胞增殖。另外，Yang S 等研究發現100 μM RES 作用于人結腸癌細胞HT29 細胞24 h 后，使HT-29 細胞的增殖減少了45.9%[29]。王純忠等研究也表明RES 可誘導SW480細胞凋亡，將細胞阻滯于G1 期，其研究結果顯示游離RES作用于SW480細胞24 h，IC50值為43.66 μg·mL-1；作用48 h，IC50 值為26.81 μg·mL-1[30]。而本課題實驗結果表明，游離RES 與SW480 細胞共孵育24 h 和48 h后，其IC50 值分別為24.03 μg·mL-1和20.81 μg·mL-1；而RES 納米粒子與SW480 細胞共孵育24 h 和48 h后，其IC50 值最低分別降低 至7.51 μg·mL-1和1.47 μg·mL-1，大大降低了RES 抗結腸癌治療濃度。結合文獻報道和本研究結果表明，RES 納米粒子增加了水難溶性RES 的溶解度，增強了RES 對結腸癌細胞增殖的抑制作用，達到了藥物緩釋效果，提高了RES的生物利用度，為臨床結腸癌治療提供了一定的實驗依據，同時也證明了納米藥物傳遞系統在腫瘤治療有良好的應用前景。