糖腎平對糖尿病腎病大鼠足細胞凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響＊

王穎超，劉運華，張豐豐，趙 敬，楊 敏＊＊，趙宗江＊＊

（1. 北京航天總醫院 北京 100007；2. 北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029；3. 中國實驗方劑學雜志 北京 100700）

據一項權威的流行病學調查報告顯示，我國糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者的總數高達1.14 億之多，已經達到了世界的糖尿病患者總人數的1/3[1]，DM對人類健康的危害和世界經濟造成的損失不亞于腦血管疾病、惡性腫瘤。 糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是DM 長期損害機體伴發的一種嚴重并發癥，隨著病情的進展，最終一步步惡化為終末期腎病，導致患者不得不依靠透析來維持生命[2,3]。因此，全球醫學界DM 研究領的重難點之一便是DN，而深入研究DN 的發病機制，探求有效的防治的方法對于攻克DN 來說，具有重要的研究意義和研究價值。病理研究顯示，DN 的主要病理改變是腎間質纖維化和腎小球硬化。不少針對足細胞的研究表明，足細胞的損傷和凋亡對DN 腎小球硬化和間質纖維化病變有著至關重要的影響[4]。大量研究顯示磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3 Kinese/Protein KinaseB，PI3K/AKT）信號轉導通路，在體內的抗凋亡過程中發揮著舉足輕重的作用，而PI3K/AKT 信號轉導通路的激活又依賴于nephrin-CD2AP 復合體的作用[5]。

糖腎平在多年臨床DN 的預防和治療中展現出了顯著的療效，它是依據趙宗江教授多年來研究文獻資料并在大量臨床基礎上提出的DN“腎痿”理論所組建的[6]。并且，我們課題組前期的實驗研究證明，糖腎平能通過影響各種信號通路途徑保護腎小球濾過屏障的正常功能，減輕甚至逆轉足細胞的損傷，降低氧化應激反應[7-9]。因此，本實驗在前期的實驗基礎上，進一步研究糖腎平對DN 大鼠足細胞凋亡的影響和對通過PI3K/AKT通路抗凋亡通路的機制。

1 材料

1.1 動物

74 只清潔級雄性Wistar 品種大鼠，體重（200 ±20）g，購自北京華阜康生物股份有限責任公司（許可證編號：SCXK京2009-0007）。

1.2 藥物及試劑

厄貝沙坦片（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號：J20080061）；糖腎平（組成：生黃芪6 g、水蛭2 g、山萸肉2 g、熟地黃3 g、地骨皮3 g、丹皮3 g，批號：2006008，北京中醫藥大學中藥學院制劑室制備）；鏈脲佐菌素（批號：S0130，Sigma 公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（批號：1168481791，中杉金橋公司）；胰蛋白酶（批號：41500-067，Gibco 公司）；DAB（批號：CW0125A，康為世紀生物科技有限公司）；Triton（批號：9002-93-1，Sigma）；PI3K（批號：2382072，Monoclonal 公司）；AKT（產品批號：4691，Cell Signaling Technology 公司）；Bad（批 號：ab62465，Abcam Technology 公司）；山羊血清封閉液（批號：120312，中杉金橋公司）；GFVisionTM Ⅱ抗（批號：2013102801，上海基因科技有限公司）；A3500（批號：00000541604，Promega公司）；Marker（批號：071513，賽百盛基因技術有限公司）。

1.3 儀器

普通顯微鏡（日本Olympus 公司，型號L340099），電熱恒溫培養箱20-60℃（湖北省黃石市醫療器械廠，型號skp-01），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號Gel Doc XR+），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號T100），電源（美國Bio-Rad 公司，型號041BR111842），Image J圖像分析軟件。

2 方法

2.1 動物模型制備與分組

適應性喂養購買的74只Wistar大鼠1周，根據體質量按照隨機數字表法分為10只正常組和64只造模組。通過多次預實驗最終確立STZ 的注射劑量為45 mg·kg-1，按照此用藥標準對大鼠進行一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（用檸檬酸緩沖液配STZ 為1%的溶液，放置在冰上用鋁箔紙遮蓋避光，時間不超過30 min），建立DKD 動物模型。72 h 后分別采取尾靜脈取血法和代謝籠法檢測大鼠血糖和尿糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1和尿糖4 個“＋”為糖尿病大鼠造模的成功標準[5]。然后把造模成功的大鼠再按照每組16 只得標準隨機分為模型組、厄貝沙坦組、糖腎平小劑量組和糖腎平大劑量組。按照人臨床用藥劑量和1 mL/100 g體質量系數標準換算灌胃藥量，確立糖腎平小劑量組0.525 g·kg-1、大劑量組2.1 g·kg-1和厄貝沙坦組17.5 mg·kg-1的標準每日灌胃，模型組給與等量生理鹽水，全部大鼠均按每籠不超過6 只得標準分籠飼養在潔凈動物櫥，采用普通大鼠飼料喂養，用標準水瓶給予飲水，每日更換木質墊料及打掃潔凈動物房。

2.2 觀察指標及測定

2.2.1 一般情況

每天按時觀察并且記錄大鼠的精神狀態、毛發色彩和光澤度、飲食飲水量大小的變化以及二便及活動情況等，每周一對大鼠進行體質量測定。

2.2.2 TUNEL染色

從-20℃取出切片，4℃30 min，室溫30 min；常規脫蠟至水，同HE 染色，0.5%胰蛋白酶37°C 40 min，滴加TUNEL 37°C 80 min；（陰性對照組：加50 μL 熒光素標記的dUTP 液即試劑2；陽性對照組：加反應混合液。試劑1∶試劑2 = 1∶20；現配現用），滴 加50 μL converter-POD 37℃50 min；DAB顯色，蘇木素復染2 min，常規脫水，中性樹膠封片。

2.2.3 免疫組化檢測大鼠腎組織中PI3K、AKT、Bad蛋白表達情況

取4℃保存的石蠟切片，復溫半小時后石蠟切片常規脫蠟至水，Triton、CH3OH-H2O2分別孵育10 min；使用微波爐進行抗原修復；蛋清、山羊血清進行封閉，滴加稀釋好的一抗（WT-1 濃度為1∶200，PI3K 濃度為1∶100，AKT 濃度為1∶200，Bad 濃度為1∶1200，陰性對照組加PBS），把濕盒放于冰箱中4℃過夜，第二日復溫后滴加HRP標記二抗，紗布擦干后DAB顯色3 min，在蘇木素染缸中復染后流水沖洗返藍10 min，最后中性樹膠封片。

2.2.4 大鼠腎組織PI3K、AKT、Bad、CD2AP 及nephrin mRNA的表達

RT-PCR 檢測上述指標的mRNA 的表達，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.4 統計學分析

免疫組化用Image-pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析，在40 倍物鏡下，每組記數20 個腎小球內足細胞數目，取平均數；TUNEL 染計數每張圖片中陽性細胞數及總細胞數，計算調亡百分率（Apoptotic index，AI）=陽性細胞數/總細胞數并進行統計分析。RT-PCR 實驗重復3 次，用ImageJ 圖像分析軟件，進行圖像分析。所有統計用均采用SPSS22.0 軟件進行數據處理，計量資料以±s表示；采χ2 檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般狀況

對大鼠進行STZ 腹腔注射72 h 后，模型組大鼠開始逐漸有多飲、多食、多尿、形體消瘦的變化，模型組在第6周后體重明顯下降、皮毛干枯并且動作遲緩；部分大鼠還出現了尿路感染、白內障等多種糖尿病并發癥。到14 周末取材為止共死亡5 只大鼠，治療組大鼠的一般狀態均有不同程度的改善。

3.2 糖腎平對STZ 誘導的DN 大鼠腎小球細胞凋亡的影響

通過TUNEL檢測計算細胞凋亡率進行分析，結果發現正常組腎小球內細胞調亡較少；與正常組相比，模型組細胞調亡率明顯增加，有顯著性差異（P＜0.01）。厄貝沙坦組及糖腎平治療組的細胞調亡率與模型組相比顯著降低（P＜0.01）（表2，圖1，圖2）。與正常組相比，模型組腎小球足細胞數目明顯減少（P＜0.01）；而經過厄貝沙坦組及糖腎平，厄貝沙坦組及糖腎平治療組足細胞數量明顯增加（表2，圖1，圖2）。

表2 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎小球細胞凋亡率的影響（AI，±s）

表2 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎小球細胞凋亡率的影響（AI，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F足細胞數18.6±0.72**8.5±0.51 11.3±0.62**11±0.46**12.4±0.7**10.31 AI 0.16±0.012**0.52±0.042 0.35±0.045**0.31±0.022**0.26±0.015**18.31

圖1 腎組織TUNEL染色（TUNEL×400）

圖2 腎組織免疫組化WT-1蛋白表達（IHC×400）

3.3 糖腎平對STZ 誘導的DN 大鼠腎組織中PI3K、AKT、Bad蛋白表達的影響

正常組大鼠的腎小球內PI3K、AKT 表達較多，Bad蛋白表達減少與模型組相比有統計學差異（P＜0.01），厄貝沙坦組、糖腎平大劑量組PI3K 蛋白表達增多，糖腎平大劑量組AKT 蛋白表達增多，與模型組相比具有顯著統計學差異（P＜0.01），糖腎平小劑量組PI3K、AKT 蛋白表達增多有統計學差異（P＜0.05）與模型組比較，厄貝沙坦組及糖腎平各治療組Bad 蛋白表達明顯減少（P＜0.01）（表3，圖3，圖4，圖5）。

表3 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、Bad的影響（OD，±s）

表3 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、Bad的影響（OD，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。a 正常組；b 模型組；c 厄貝沙坦組；d 糖腎平小劑量組；e 糖腎平大劑量組；f陰性對照組

組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F AKT 0.539±0.013**0.468±0.012 0.491±0.006 0.498±0.007*0.511±0.007**7.49 PI3K 0.48±0.014**0.39±0.012 0.44±0.012**0.42±0.012*0.47±0.012**9.87 Bad 0.182±0.009**0.303±0.012 0.239±0.006**0.246±0.024**0.218±0.007**10.84

圖3 腎組織免疫組化PI3K蛋白表達（IHC×400）

圖4 腎組織免疫組化AKT蛋白表達（IHC×400）

圖5 腎組織免疫組化Bad蛋白表達（IHC×400）

3.4 糖腎平對STZ 誘導的DN 大鼠腎組織中nephrin、CD2AP、PI3K、AKT、BadmRNA表達的影響

正常大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKTmRNA呈高表達，而BadmRNA 少量表達；DN 大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKTmRNA 表達明顯減少（P＜0.01），BadmRNA 表達明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，厄貝沙坦組腎組織中CD2AP、nephrinmRNA表達增多（P＜0.01，P＜0.05）；PI3K、AKTmRNA 表達增多（P＜0.05）；BadmRNA 表達明顯減少（P＜

0.01）。與模型組相比，糖腎平大劑量組腎組織中CD2AP、nephrin、AKTmRNA 表達增多（P＜0.01）；BadmRNA 表達明顯減少（P＜0.01）；PI3KmRNA 表達增多但無明顯統計學差異。糖腎平小劑量組腎組織 中CD2AP、AKT、nephrin、PI3K mRNA 表 達 增 多（P＜0.05），BadmRNA 表達明顯減少（P＜0.01）（表4，表5，圖6）。

表4 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎組織CD2AP、nephrin mRNA表達的影響（±s，n = 3）

表4 糖腎平對STZ誘導DKD大鼠腎組織CD2AP、nephrin mRNA表達的影響（±s，n = 3）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

nephrin 1.24±0.035**0.75±0.045 0.89±0.030*0.79±0.067 1.168±0.011**28.1組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F CD2AP 0.70±0.017**0.55±0.028 0.65±0.005**0.61±0.026*0.65±0.011**8.7

表5 糖腎平對DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、BadmRNA表達的影響（±s，n = 3）

表5 糖腎平對DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、BadmRNA表達的影響（±s，n = 3）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

Bad 0.83±0.024**1.10±0.045 0.93±0.025**0.93±0.021**0.87±0.028**12.2組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F AKT 0.76±0.038**0.49±0.050 0.65±0.060*0.62±0.024*0.70±0.039**5.59 PI3K 1.22±0.124**0.73±0.031 0.99±0.026*0.89±0.081 0.90±0.093 5.14

圖6 大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、AKT、PI3K、Bad mRNA電泳圖

4 討論

在我國經濟迅猛發展、人口老齡化的社會趨勢影響下，DM 的發病率年年攀升。目前，我國成年人中DM 患者約占7%，總人數高達0.92 億[10]。DN 是DM 最為常見的并發癥，它是嚴重威脅人類健康慢性疾病之一，往往最終進展為回天乏術的終末期腎病[11]。DN 最為主要的病理改變是腎小球硬化和腎間質纖維化，而足細胞（podocyte）主要有維持腎小球濾過膜結構和功能正常的作用，在DN的發病中起著關鍵的作用，當足細胞受到高糖和炎癥等的刺激，便會發生形態的改變，甚至發生凋亡脫落，從而對腎小球的正常功能造成不可挽救的損害。PI3K/AKT信號轉導通路參與足細胞生長、分化、凋亡的調控[12]，研究表明，足細胞裂孔蛋白CD2AP和nephrin復合體可以與PI3K-P85亞基結合，參與并激活PI3K/AKT 依賴的信號轉導途徑，調控足細胞的凋亡[13,14]。

糖尿病腎病歸屬于中醫“水腫”、“尿濁”、“關格”、“腰痛”、“腎消”和“消渴腎病”范疇。DN 的基本病機是本虛標實，以氣陰兩虛、精氣虧耗、陰陽兩虛為本虛，以燥熱內生、水濕潴留、濕濁瘀毒為標實，病位在腎可累及肝、脾。DM 日久不愈，耗損機體氣血津液，“久病多虛”可見DN的發病是以虛為本[15]。DN久病不愈，外熱、郁、痰濕、瘀血、毒邪相互膠結于腎臟，導致腎臟的正常生理功能損失，大量的有害物質聚集在腎組織內，長此以往，腎臟廢萎不用，即發為“腎萎”。腎萎不用，導致水濕、濕濁、瘀毒內阻，阻礙腎臟氣血運行，日久更甚，失去固攝精微的能力，因此出現蛋白尿。DN 不同時期的病理是不同的，早期正氣不足，邪氣稽留，瘀血阻滯，邪氣與濁毒凝集，形成癥瘕積聚腎內，從而可見腎臟體積增大；中晚期，癥瘕日久，瘀血濁毒不斷損傷腎臟的正常生理結構，從而發生腎小球硬化和腎間質纖維化，最終可發為終末期腎病。糖腎平是在“腎萎”假說指導下，按照君臣佐使組方的復方。方中君藥黃芪能夠利尿消腫、補中益氣、固攝精微；臣藥熟地黃和山萸肉能夠補肝滋腎和益氣生津；佐藥丹皮和地骨皮共奏活血化瘀和清退蓄熱，使藥水蛭起破血消癥之功。全方以滋補肝腎、益氣固精為主，以活血化瘀通腎絡為輔，其特色為補而不滯，祛瘀而不傷正。祛瘀毒的同時不傷正氣，瘀去濁降除宿根，使氣陰充養，助脾氣、腎精的化生，適宜于治療DN之氣陰兩傷、瘀血阻絡、精微下泄等癥。糖腎平在多年臨床和實驗上都展現出了對DN 的顯著療效[16,17]，大量組織細胞分子生物實驗研究證實，糖腎平能夠顯著降低DN 大鼠24 h尿蛋白量，改善DN 大鼠的氧化應激狀態，緩解DN 大鼠腎臟的病理改變，抵抗足細胞的損傷和凋亡[9]。

PI3K/AKT 信號通路是參與調控細胞生長和凋亡的關鍵通路之一，而磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）為該通路的關鍵細胞因子，它具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性，PI3K 被激活后會轉變成第二信使PIP3，PIP3 接著又會把AKT[18]活化為p-AKT，而p-AKT 又可以通過阻斷凋亡分子Bad 與Bcl-2/Bcl-xL 的結合從而抑制細胞凋亡的發生[19]。本實驗通過TUNEL檢測到糖腎平可降低腎小球中細胞凋亡率，維持足細胞正常生理；免疫組化和RT-PCR結果同時表明，糖腎平能明顯增加大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKT 的蛋白和mRNA 表達，降低Bad 蛋白和mRNA 表達。除此之外，本課題組還應用Western blot方法測定了離體培養的足細胞的相關蛋白，發現糖腎平可以維持足細胞裂孔隔膜蛋白穩定蛋表達，保護腎小球濾過屏障，同時進一步激活PI3K/AKT 信號通路，抑制足細胞凋亡，相關結果已發表[20]。

綜上，糖腎平可能通過保護足細胞胞裂孔蛋白，維持足細胞正常的形態和功能，進而保持完整的腎小球濾過屏障，減輕蛋白尿的癥狀，并進一步激活PI3K/AKT 信號轉導通路，從而抑制了足細胞凋亡，減輕腎臟損傷、減輕腎纖維化。