姜黃素治療骨性關節(jié)炎藥理的研究進展＊

夏天衛(wèi)，劉金柱，崔婧嫻，環(huán)大維，沈計榮

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南京 210029）

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見的骨關節(jié)疾病，尚無有效的治療藥物，造成極大的經(jīng)濟與社會負擔。中醫(yī)多將OA 稱為“痹證”，自《黃帝內(nèi)經(jīng)》開始就有大量關于痹證的文獻記載，故從中醫(yī)中挖掘治療OA的藥物具有重要意義。

姜黃是中醫(yī)常用藥，為姜科姜黃屬植物姜黃的根莖，性溫味苦，歸肝、脾經(jīng)，有破血通經(jīng)、行氣止痛之效?！缎滦薇静荨吩唬骸爸餍母菇Y積，下氣，破血，除風熱，消癰腫，功力烈于郁金”?！稐钍霞也胤健分蓄帽詼从媒S配伍當歸、白芍等主治手足冷痹，腰膝沉重。

姜黃素[C21H20O6，1,7-二-(4-羥基-5-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮]（圖1）是姜黃的主要活性成分（含量3-5%），為橙黃色結晶粉末，相對分子質(zhì)量368。聯(lián)合國食品添加劑聯(lián)合專家委員會和歐盟食品安全委員會聯(lián)合評定認為姜黃素不對人與環(huán)境構成任何威脅。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素類具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗癌[3]、抗阿爾茨海默病[4]、治療糖尿病等多種活性[5]?，F(xiàn)主要介紹姜黃素治療OA 基礎藥理與臨床藥理的研究進展。

圖1 姜黃素化學結構

1 基礎藥理研究進展

1.1 抑制關節(jié)炎癥

1.1.1 結構特點

姜黃素抗炎的活性基團是苯丙酞基，1,3-酮基是其發(fā)揮抗炎活性的必需基團，而苯環(huán)上的4-酚羥基和側(cè)鏈α、β-不飽和羰基中的雙鏈可增強其抗炎活性。

1.1.2 機制

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路在OA 進程中發(fā)揮重要作用。當細胞受到外環(huán)境刺激時，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑、核因子-κB 誘導激酶-1（NF-κB inducingkinase-1，NIK）等相繼激活，進而激活κB 抑制蛋白激酶（inhibitoryκB protein kinase，IKK），導致κB抑制蛋白（inhibitoryκB proteins，IκB）磷酸化、與NF-κB分離。NF-κB 入核與炎癥介質(zhì)靶基因啟動子區(qū)的κB位點相結合，增強炎癥反應相關基因的表達。姜黃素能夠抑制人軟骨細胞中IKK 的激活，抑制IkBα磷酸化，抑制NF-κB 信號通路，進而抑制環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因和一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因的轉(zhuǎn)錄（圖2）。

圖2 抗炎NF-κB信號通路作用機制示意

NOD樣受體3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是在胞漿內(nèi)廣泛表達的模式識別受體，在病原/損傷相關分子模式（pathogen/damage-associated molecular pattern，P/DAMP）的刺激下，NLRP3 可以和凋亡相關點狀蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）形成炎癥小體。Toll 樣受體激動劑[如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]和細胞因子[如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）]能激活NLRP3 基因的轉(zhuǎn)錄，進而激活非活性狀態(tài)的Caspase-1（pro-Caspase-1）、活性狀態(tài)的Caspase-1，促進炎癥。OA 時NLRP3 表達增高[6]，NLRP3 激活Caspase-1，后者參與白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18 的產(chǎn)生與分泌，加劇OA 進程。Yufeng Sun 等用LPS 和三磷酸腺苷（ATP）誘導人單核巨噬細胞系發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制NLRP3 的表達、活化與釋放，抑制pro-Caspase-1、Caspase-1、炎癥因子的表達，延緩OA進程[7]。

激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是一種促炎轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控ILs 和金屬蛋白酶（matrix metalloprotease，MMPs）的表達。姜黃素能夠抑制AP-1的激活，抑制炎癥。

姜黃素還能抑制炎癥反應上游磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、COX-2、5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LOX）、iNOS的活性，進而抑制中游IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，再進而抑制下游MMP-3、MMP-9等對軟骨基質(zhì)的分解作用[8-10]。

1.1.3 相關實驗簡介

Yufeng Sun 等構建了小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定（destabilization of the medial meniscus，DMM）的模型，實驗組每天腹腔注射50 mmol·L-1姜黃素，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠降低IL-1β、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-17α、IL-18、TNF-α、血管細胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）的表達，抑制小鼠OA 的炎癥反應[7]。Zhuo Zhang 等發(fā)現(xiàn)小鼠口服姜黃素能夠減緩OA 進程。免疫熒光顯示局部外用的姜黃素納米微粒可滲透進小鼠的髕下脂肪墊。組織學染色顯示姜黃素微粒能夠減輕小鼠滑膜炎；實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測顯示姜黃素微粒能夠減少其髕下脂肪墊內(nèi)脂肪因子（脂肪酶、脂聯(lián)素、瘦素）、炎癥相關轉(zhuǎn)錄因子（轉(zhuǎn)錄因子CCAAT 增強子結合蛋白β、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ激動劑）、促炎因子的表達[11]。

1.2 抑制氧化

1.2.1 結構特點

姜黃素具有酚羥基、甲氧基、β-二酮3個抑制氧化的活性部位。Chen 等證明在pH6.8 的環(huán)境下，姜黃素抗氧化活性由酚羥基決定；而在pH8.0的環(huán)境下，則由酚羥基、甲氧基與1,3-二酮結合形成的雙烯系統(tǒng)共同決定[13]。

1.2.2 機制

自由基是一種強氧化基團，病理狀態(tài)下機體產(chǎn)生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）與活性氮自由基（nitrous oxide systems，NOS），造成一系列損傷。OA 中，ROS 和RNS 升高，能夠抑制Ⅱ型膠原、蛋白多糖等軟骨基質(zhì)的合成，同時加速其分解。姜黃素活性部位在抗氧化過程中提供質(zhì)子，可有效清除自由基[12]

姜黃素可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子核因子E2 相關因子

2（nuclear factor-E2- related factor 2，Nrf2-ARE）、NF

κB、MAPK、Notch、AMP 相關蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷 酸/活 性 氧（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase/ROS，NADPH/ROS）等信號通路增加抗氧化酶活性、調(diào)控氧化應激。姜黃素能夠促進Nrf2-Keap1 解偶聯(lián)，導致Nrf2 入核，上調(diào)血紅素加氧酶（HO-1）表達，抑制NF-κB 活化，抑制炎性因子分泌，降低氧化應激損傷[14-15]。在Notch1 信號通路中，姜黃素能夠下調(diào)發(fā)狀分裂相關增強子（hairy enhancer of split，Hes1）、Notch、Caspase-3的表達，上調(diào)Bac-2的表達，減少ROS 和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的釋放，增加抗氧化的丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）活性[16]。

1.2.3 相關實驗簡介

李旭升等給OA 小鼠腹腔注射100mg/kg 姜黃素，發(fā)現(xiàn)姜黃素治療組軟骨細胞中p-兩面神激酶2（pjanus kinase 2，p-JAK2）、p-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（p-signal transductors and activators of transcription 3，p-STAT3）表達升高，促凋亡的Bax 蛋白表達降低，線粒體琥珀酸脫氫酶（succinodehydrogenase，SDH）和細胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）表達升高。提示姜黃素激活JAK2／STAT3信號通路，增強軟骨細胞線粒體抗氧化應激能力，延緩其退變[17]。Nora M.Aborehab 等使用含有姜黃混合物喂養(yǎng)大鼠后，發(fā)現(xiàn)軟骨中SOD、MDA 水平升高，提示潛在活性成分姜黃素具有抗氧化作用[18]。

1.3 抑制軟骨基質(zhì)分解和促進軟骨基質(zhì)修復

1.3.1 抑制軟骨基質(zhì)分解

IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子通過促進mRNA的表達增強各種MMPs（MMP-1、3、13 等）的合成、分泌，MMPs 參與降解軟骨基質(zhì)蛋白。含有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS-5）能降解蛋白多糖，亦造成軟骨損傷。劉巍等用IL-lβ刺激兔軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著抑制IL-8 和可溶性黏附分子l（soluble intercellular adhesion molecule 1，sICAM-l）的分泌，對軟骨有保護作用[19]。Shakibaei 等發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制IL-1β/TNF-α誘導的人軟骨細胞MMP-3、MMP-9的表達[20]。孫達鋒等發(fā)現(xiàn)關節(jié)腔注射姜黃素能顯著緩解軟骨的退變[21]。Zhuo Zhang 等發(fā)現(xiàn)局部外用姜黃素納米微粒抑制MMP-1、ADAMTS-5 的表達，減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的分解，減輕軟骨損傷[11]。關節(jié)軟骨損傷時，軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）分泌增加。Nora M.Aborehab 等使用含有姜黃混合物喂養(yǎng)大鼠后，發(fā)現(xiàn)大鼠軟骨組織中IL-1β、COMP、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）水平明顯降低，提示潛在活性成分姜黃素發(fā)揮軟骨保護作用[18]。

1.3.2 促進軟骨基質(zhì)修復

整合素介導的力化學通道參與OA 軟骨細胞外基質(zhì)的合成，多種應力刺激均可通過激活細胞表面的整合素發(fā)揮軟骨修復作用。Shakibae 等發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著增強軟骨細胞Ⅱ型膠原、軟骨特異性糖蛋白（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）、β1整合素的表達[20]。

1.4 影響細胞凋亡

1.4.1 抑制軟骨細胞凋亡

正常情況下，淺表層的軟骨細胞高表達微管相關蛋 白1輕鏈（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和Beclin1，參與維持軟骨細胞自噬與穩(wěn)態(tài)。LC3在核內(nèi)經(jīng)去乙?；刃揎椇螅D(zhuǎn)運至胞質(zhì)內(nèi)，變成胞漿型LC3（LC3-Ⅰ）。自噬時LC3-I 被酶解為LC3-Ⅱ并定位于自噬體膜上，直到與溶酶體融合。同時Beclin1 參與形成Beclin1-Ⅲ型磷脂酰肌醇-3 激酶（PI-3K）復合體，促進自噬。中晚期OA 軟骨細胞的自噬水平下降，LC3Ⅱ等表達水平下降，凋亡增加，退變明顯[22]。細胞衰老退變時線粒體內(nèi)細胞色素C 外漏，Caspase級聯(lián)激活，導致細胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2能夠阻止線粒體里細胞色素C的釋放。

體外實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素一方面增強細胞外信號調(diào)節(jié) 激 酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）磷酸化、激活MAPK/ERK1/2 信號通路，促進自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclin1 的表達、促進自噬；另一方面增加Bcl-2 的表達、抑制參與裂解DNA 并執(zhí)行細胞凋亡的Caspase-3酶的活性，共同抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡（圖3）[23,24]。姜黃素還能增加抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達[25]。

1.4.2 促進滑膜細胞凋亡

姜黃素能夠增強塞來昔布促進OA 滑膜細胞凋亡的效果。但體外促進滑膜細胞凋亡所需的姜黃素局部濃度遠高于口服姜黃素時血漿中最高濃度[26]。

圖3 抗凋亡作用機制示意

1.5 調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖

體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)姜黃素低濃度時促進軟骨細胞增殖，高濃度時抑制軟骨細胞增殖。馬勇等發(fā)現(xiàn)：①姜黃素通過促進Wnt 信號分子與細胞膜上Frizzled蛋白結合，激活胞內(nèi)散亂的蛋白，使糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthase kinase-3β，GSK-3β）失活，使胞質(zhì)內(nèi)β-環(huán)連蛋白（β-catenin）積累，繼而更多的入核誘導基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促進細胞增殖分化的蛋白，發(fā)揮保護軟骨的作用。②姜黃素對正常軟骨細胞具有促增殖作用，在10 μmol·L-1濃度、作用24 h 條件下促增殖效果最顯著[27]。陳瓊等發(fā)現(xiàn)姜黃素對軟骨細胞增殖的抑制作用具有特異性：40 μmol·L-1以上姜黃素對OA 軟骨細胞有抑制效應，而80 μmol·L-1以上姜黃素對正常軟骨細胞才發(fā)揮抑制效果[28]。

1.6 維持成骨活性與抑制破骨活性

姜黃素脂質(zhì)體能下調(diào)炎癥因子的表達維持成骨細胞的活性，上調(diào)骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/核因子kB 受體活化因子配體（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）的比例抑制破骨細胞的活性，抑制OA 進程[29]。WEI SHANG 等發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制MAPK/核因子κB 受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）/c-Fos/核因子活化的T細胞C1（nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1）信號通路，抑制破骨細胞活性[30]。

2 臨床藥理試驗進展

通過Pubmed、Cochrane Library、Embase 等檢索發(fā)現(xiàn)臨床隨機、對照試驗（randomized controlled trial，RCT）8 篇。Nakagawa 的試驗組每天口服Theracurmin（含180 mg 姜黃素），1 天6 片。治療8 周后，試驗組VAS評分和對塞來昔布的依賴性明顯降低[31]。Belcaro的試驗組每天服用500 mg Meriva（含100 mg 姜黃素）和500 mg 氨基葡萄糖，4 個月后試驗組各項評分（WOMAC評分、Karnofsky指數(shù)評分、平板試驗）顯著改善[32]。Chandran 的試驗組每天給予1000 mg 姜黃素，連續(xù)6 周[33]；Pinsornsak 的試驗組每天給予500 mg 姜黃素，連續(xù)8 周[34]；Madhu 的試驗組每天給予500 mg 姜黃素，連續(xù)6 周[35]；Pannahi 的試驗組每天給予1500 mg 姜黃素，連續(xù)6周[36]；Kuptniratsaikul的試驗組首次試驗每天給予1000 mg 姜黃素，連續(xù)6 周，二次試驗每天給予1500 mg 姜黃素，連續(xù)4 周[37,38]，均取得較好療效[33-38]。有學者對上述文獻進行Meta 分析顯示每天口服1000 mg 姜黃素有顯著治療OA 效果[39]。與非甾體類抗炎藥不同，姜黃素對胃腸道黏膜有保護作用，但仍需長期大樣本臨床研究證實[40]。

3 問題、對策與展望

姜黃素不溶于水，在各溶劑中的溶解度偏低?？诜S素在小腸的吸收率低，在肝臟中代謝快，穩(wěn)定性差，生物利用度僅1%。有學者認為在常規(guī)的藥物化學篩選中姜黃素自身能散發(fā)熒光，是“泛篩選干擾化合物（pan-assay interference compounds，PAINS）”；同時能破壞細胞膜，干擾藥物篩選試驗。姜黃素滲透性低，劑量分布不均[41]，缺乏專一靶向，代謝時降解成具有多種化合物。這些化合物自身也可能散發(fā)熒光，故有學者認為姜黃素是“無效的代謝萬能藥（invalid metabolic panaceas，IMP）”。有研究報道姜黃素不能抑制IKK 的激活，不影響IκBα的表達和降解。有實驗報道姜黃素增加體外C-28/12 軟骨細胞系表達MMP-3和ADAMTS5[42]。還有關于姜黃素螯合鐵離子、影響鐵代謝的報道。

目前已有大量研究試圖解決姜黃素的前四點不足：有學者嘗試用環(huán)糊精技術、制成膠束[43]、制成高分子共聚物[44]等手段提高姜黃素的溶解度、緩釋性。有學者發(fā)現(xiàn)用環(huán)糊精加磷脂技術修飾姜黃素，能進一步提高其水溶性、生物利用度[45]。有學者發(fā)現(xiàn)通過脂質(zhì)體的分子間自組裝技術包裹姜黃素后，能減少降解和生物轉(zhuǎn)化[46]。Michal Heger 等認為熒光篩選實驗有不可低估的價值，在《Nature》上論證不認可姜黃素是“PAINS”[47]。有學者通過把姜黃素制成微乳、微球、納米粒[48]來改善其穩(wěn)定性、生物利用度，同時賦予其緩釋和靶向性能。針對第五、六點問題，有學者認為這可能和體外軟骨培養(yǎng)模型不同相關[42]。治療OA 的姜黃素每日劑量一般小于2000 mg，該劑量下尚未發(fā)現(xiàn)影響鐵代謝。

筆者認為研發(fā)與應用姜黃素治療OA 具有廣闊的前景，建議未來的研究可從以下3個方面深入：①探究姜黃素的不同給藥途徑（如口服、局部經(jīng)皮外用、關節(jié)腔注射等）對其治療作用的影響，尋找姜黃素治療OA的最佳給藥方式、給藥濃度與給藥劑量。②對如何提高姜黃素的穩(wěn)定性、水溶性、生物利用度等進行研究（如以姜黃素為先導，研發(fā)其衍生物、類似物、全合成產(chǎn)物等）。③有學者研究發(fā)現(xiàn)姜黃的其他有效成分（如芳姜黃酮）也具有抗炎等活性[49]，故未來還可以對姜黃的其他有效部位及成分展開研究。