外泌體作為中藥新活性成分的研究進(jìn)展＊

高文靜，侯 敏，王 攀，藺亞東，劉建勛，任鈞國＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

由于外泌體的膜結(jié)構(gòu)以及特殊的胞質(zhì)成分，使其在動(dòng)物的生理和病理過程中起著重要的介導(dǎo)作用[1]。研究者們在動(dòng)物外泌體上不斷有新的發(fā)現(xiàn)和突破，如來自梗死心肌的外泌體miRNA 能夠動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)心肌損傷修復(fù)[2]；由胃腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可以通過遞送miR-135b 來抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的FOXO1表達(dá)并促進(jìn)血管生成等。此外，以動(dòng)物細(xì)胞外泌體為載體，攜帶植物miRNA 進(jìn)行疾病治療的研究也是一大熱點(diǎn)，例如將漿果的花青素載入巨噬細(xì)胞外泌體，用以治療卵巢癌[3]，但是單純利用藥用植物外泌體治療疾病的研究則較少。

植物藥是中藥的主要組成部分，其所含的黃酮、皂苷、生物堿等次生代謝產(chǎn)物已被系統(tǒng)性研究。但由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，許多中藥的有效成分及作用機(jī)制仍未得到有效闡釋[4]。隨著在人乳中檢測到的植物miRNA，并且可能影響著嬰兒體中幾條重要的生物途徑[5]，以及美國加州大學(xué)河濱分校金海翎教授課題組發(fā)現(xiàn)了宿主擬南芥細(xì)胞外泌體可以傳遞sRNAs 至真菌病原體灰霉病菌并富集，誘導(dǎo)關(guān)鍵致病性真菌基因沉默[6]等，以藥用植物外泌體作為中藥活性成分進(jìn)行的研究也在逐漸展開。本文整理了生姜、紅景天、蒲公英、金銀花等中藥外泌體的相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)了植物外泌體的提取方法，并對中藥外泌體的應(yīng)用進(jìn)行了探討。

1 外泌體的形成與特征

1.1 外泌體的形成

外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵信使[7]，是由多囊體與質(zhì)膜融合，將多泡內(nèi)含體釋放到細(xì)胞外環(huán)境中形成的。而這些多泡內(nèi)含體則是外泌體的前體，其包含著RNA(包括mRNA、miRNA 和其他非編碼RNA)、DNA 和脂質(zhì)[8]（圖1）。此外，有研究表明，在中藥煎煮過程中，外泌體可以維持miRNA 的穩(wěn)定性[9]，并將miRNA 等物質(zhì)傳送給靶細(xì)胞，介導(dǎo)多種生理和病理過程[1,7]。

1.2 外泌體的特征

1.2.1 形態(tài)特征

目前對動(dòng)物的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行了分類，按囊泡特定的蛋白質(zhì)標(biāo)記和來源多被分為（1）外泌體、（2）微粒/微囊泡、（3）凋亡小體等三類[1]。外泌體的直徑大約在40-150 nm[8]之間，藥用植物外泌體與動(dòng)物外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)相類似[10]，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級小囊泡，呈茶托狀或杯狀[11]，其形態(tài)可以利用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 生化特征

外泌體內(nèi)含DNA、特異蛋白質(zhì)和復(fù)雜RNA 等，可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移傳遞核酸、生物活性脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[12]。由于細(xì)胞來源不同，外泌體所含的成分也不盡相同，但蛋白類多含有膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和融合蛋白（GTPases、annexins 和flotillin），肌動(dòng)蛋白以及與代謝相關(guān)的酶類等[11]；脂質(zhì)多為鞘磷脂[13]、磷脂酰膽堿[14]、甘油類[15]等；核酸類成分多為miRNA、mRNA、DNA 等。此外，不同來源的細(xì)胞根據(jù)其特性所含的成分種類及含量都有所變化，例如生姜外泌體中含有較高的6-姜酚等化學(xué)成分[15]。

圖1 外泌體的形成[16]

2 外泌體的分離與鑒定

2.1 外泌體的分離

外泌體的分離是一般根據(jù)其特殊的理化性質(zhì)[17]，如大小、形狀、密度、電荷、溶解度、表面蛋白和膜脂組成等進(jìn)行分離。現(xiàn)在隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多用來分離外泌體的技術(shù)也在被不斷開發(fā)，并且致力于提高外泌體的提取量和純度。

目前動(dòng)物外泌體常用的分離純化方法主要有超速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、多聚物沉淀法、免疫磁珠法以及尺寸排阻色譜法等（圖2）。其中超速離心法操作簡單，外泌體純度高，可用于外泌體的蛋白、DNA 和免疫功能研究[18]。密度梯度離心法一般是通過超速離心形成蔗糖濃度梯度條帶，而外泌體則多集中1.13-1.20 g·mL-1密度條帶。超濾離心是基于粒子大小的外泌體分離技術(shù)之一[19]。該法簡單高效、快速且不會影響外泌體的生物活性，也不需要特殊設(shè)備[20]，是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。缺點(diǎn)是外壓的使用可能會導(dǎo)致外泌體的變形和破裂，影響分析的結(jié)果[21]。多聚物沉淀法優(yōu)點(diǎn)是能最大程度的保留外泌體生物學(xué)活性，適用于外泌體RNA 分析研究，但是耗時(shí)長、蛋白雜質(zhì)多，不適合外泌體蛋白的研究[18]。尺寸排阻色譜法是根據(jù)分子大小進(jìn)行分離，能夠較好地保證外泌體的完整性和活性[22]。表1 對上述方法的作用原理及優(yōu)缺點(diǎn)[23-24]進(jìn)行了歸納。

圖2 外泌體的分離方法

表1 植物外泌體提取分離方法一覽表

反觀近十年植物外泌體的相關(guān)研究，大多使用了超速離心法（差速離心法）[25]聯(lián)合密度梯度離心法。例如，Li等[26]在提取生姜類外泌體納米粒子時(shí)，將粗濾過的生姜汁在4℃下以10,000 g 離心1 小時(shí)，取上清液重復(fù)2-3 次，再用100,000 g 離心80 分鐘，之后又進(jìn)行超速離心濃縮并與60%碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以40,000 rpm 轉(zhuǎn)速超離心形成了平衡密度梯度，進(jìn)而收集分析。此外，他們對葡萄柚、胡蘿卜、大蒜和姜黃的外泌體也進(jìn)行了提取，即對凈濾好的汁液進(jìn)行離心（2,000 g 離心20 min；4,000 g 離心30 min；10,000 g 離心1 h），然后將包含著植物納米粒子的顆粒在4℃，100,000 g下離心1.5 h，最后將分離出的外泌體在蔗糖梯度下進(jìn)一步純化[27]。2017 年美國印第安納大學(xué)的Brian D. Rutter[28]將過濾所得的擬南芥質(zhì)外體液體在10,000 g 下連續(xù)離心30 min，40,000 g 下60 min，和100,000 g 下60 min，經(jīng)過分析處理后，再進(jìn)行碘氧醇密度梯度離心、純化。

綜上所述，各實(shí)驗(yàn)研究的分離方法在時(shí)間和離心力的選擇上略有差別，但大同小異，多是將榨汁凈濾好的液體以小的離心力除去細(xì)胞碎片、雜質(zhì)，再用大的離心力超速離心獲取外泌體，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)材料和目的進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2.2 外泌體的鑒定

瀏覽外泌體的相關(guān)研究論文，不論是動(dòng)物還是植物外泌體，其經(jīng)典的鑒定方式多采用透射電子顯微鏡（TEM）[13,29-30]觀察其形態(tài)。有文獻(xiàn)報(bào)道，外泌體以鉬酸銨染液做負(fù)染，其結(jié)構(gòu)邊緣染色則更為清楚。在負(fù)染后透射電鏡下觀察，可見十分明顯的膜結(jié)構(gòu)，直徑在40-150 nm，且呈大小不一的茶托樣或杯狀（圖3）。同時(shí)結(jié)合納米追蹤分析技術(shù)檢測外泌體的大小及數(shù)量，可以快速、準(zhǔn)確的分析外泌體的粒徑分布，為外泌體的存在提供有力證據(jù)。

圖3 外泌體的透射電子顯微鏡圖

3 外泌體作為中藥活性成分的應(yīng)用

植物外泌體含有較為豐富的miRNA，其為一類長度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼RNA，在生物體中起著重要的作用，是一種高效的基因表達(dá)調(diào)控因子[9]。隨著一些常見植物如水稻、葡萄等miRNA 研究的擴(kuò)大和深入，藥用植物miRNA 的研究也迅速展開。且越來越多的報(bào)告顯示，miRNA 不僅在其原始系統(tǒng)內(nèi)執(zhí)行生物學(xué)功能，還可以進(jìn)行跨界基因表達(dá)調(diào)控[31]。因此，來自藥用植物外泌體的miRNA 可能作為新的生物活性成分與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)相互作用。有學(xué)者在給小鼠喂食金銀花后，在其血清和尿液中可以檢測到植物小RNA[32]。北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院通過給小鼠喂食中藥湯劑，對進(jìn)入人體組織中的中藥miRNA 進(jìn)行了大規(guī)模分析，在小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的來源于中藥的小RNA，經(jīng)過對來自NCBI GEO 數(shù)據(jù)庫的健康人體組織小RNAseq 原始數(shù)據(jù)樣本以及半枝蓮、柴胡、穿心蓮、地丁紫堇、黃芩等10 種中藥的miRNA 數(shù)據(jù)庫miRBase 進(jìn)行了篩選鑒定，最終進(jìn)一步證實(shí)了中藥miRNA 確實(shí)可以跨界轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。此外，我們經(jīng)常食用的植物性食品，其miRNA 同樣能夠人體血液中檢測到并穩(wěn)定存在[34]，并起到特定的藥理作用。因此，本文就目前主要研究的幾種中藥外泌體的抗炎、抗病毒、抗纖維化以及抗腫瘤等藥理作用進(jìn)行了歸納總結(jié)，見表2。

3.1 抗炎作用

生姜屬姜科姜屬植物，含揮發(fā)油、姜辣素、黃酮類等成分，具有抗炎、抗腫瘤、促消化等作用[35]，其中6-姜辣素具有較強(qiáng)的抗炎作用[36]。隨著外泌體的興起，2018年張皇閣教授團(tuán)隊(duì)針對生姜新的活性成分---外泌體進(jìn)行了研究，并發(fā)表了關(guān)于生姜外泌體塑造腸道菌群的文章[27]，即通過無菌小鼠和臨床試驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)生姜外泌體（Ginger ELNs，GELN）中的小RNA 能影響腸道菌群，并完善腸道的屏障功能，其中GELN-RNAs 通過激活A(yù)HR 途徑誘導(dǎo)IL-22 表達(dá)以加強(qiáng)LGG 介導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎（DSS）抑制作用。此前，其他研究團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)生姜（Ginger-Derived Nanoparticles，GDNPs）可以降低炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β），增加結(jié)腸炎模型中的抗炎細(xì)胞因子（IL-10 和IL-22）的表達(dá)[15]；對于一些非藥用的植物，如西蘭花[37]、葡萄[38]，亦分別從中提取出類似外泌體的納米粒子（Broccoli-Derived Nanoparticle，BDN；Grape Exosome-like Nanoparticles，GELNs），并發(fā)現(xiàn)BDN 可降低DSS 誘導(dǎo)的TNF-α、IL-17A 和IFN-γ的表達(dá)，增加IL-10 的表達(dá)，而GELNs 不僅可以調(diào)節(jié)腸組織的再生過程，更可以參與腸組織的重塑，從而預(yù)防或緩解結(jié)腸炎。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了植物外泌體可以被人體攝取，其包含的miRNAs 分子可以與腸道微生物相互作用以維持腸道健康，同時(shí)也從側(cè)面證實(shí)植物外泌體可以作為一種新的中藥活性成分。

表2 藥用植物外泌體的藥理作用

3.2 抗病毒作用

金銀花，主要化學(xué)成分包括五大類，即黃酮類、揮發(fā)油類、三萜皂類、無機(jī)元素以及有機(jī)元素，其中三萜皂類化合物具有良好的抗病毒作用[39]。而目前藥理作用研究多集中于抗炎作用，如金銀花提取物可以通過抑制促炎因子IL-1β和IL-18 的釋放進(jìn)而起到抗炎作用[40]。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療上則主要采用其清熱解毒功效，在治療病毒性感冒方面具有良好的效果，但是對于金銀花在抗病毒的活性成分以及機(jī)制研究上還有所空缺。為此，周振等[41]利用金銀花水煎液中提取的miRNA 2911分別進(jìn)行體內(nèi)和體外的抗病毒實(shí)驗(yàn)，并證實(shí)了miRNA 2911 不但能夠在金銀花水煎液中穩(wěn)定存在，而且直接針對各種IAV，包括H1N1、H5N1 和H7N9。該研究既表明了miRNA2911 是中藥抗病毒的有效成分，也直接證明了金銀花的抗病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一是其含有的miRNA2911 能夠顯著抑制病毒的復(fù)制。

3.3 抗纖維化作用

紅景天，作為常用中藥，主要含有生物堿、黃酮類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，具有保護(hù)心腦血管、抗纖維化、抗炎或抗病毒等功效[42]。縱觀近年來紅景天藥理作用的研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)，紅景天苷為主要活性成分之一，可以通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路起到抗炎作用[43]，其衍生物還具有抗抑郁及改善學(xué)習(xí)記憶的作用[44]。而紅景天外泌體作為新活性成分也引起研究人員關(guān)注，近期北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院蔣澄宇團(tuán)隊(duì)從紅景天中提取了含HJT-sRNA-m7 的外泌體，通過體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)其具有良好的抗肺纖維化作用[14]。該研究發(fā)現(xiàn)紅景天外泌體（湯劑體）在減輕小鼠疾病癥狀中起著重要作用，并進(jìn)一步確定藥用植物外泌體作為新的活性成分的價(jià)值。

3.4 抗腫瘤作用

腫瘤是嚴(yán)重威脅著人類健康重大疾病，中藥在治療腫瘤上起到了重要的作用，彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不足。miRNA研究的興起，讓人們逐漸意識到miRNA與腫瘤的增殖和凋亡密切相關(guān)[45]。隨著對外泌體不斷地深入研究，越來越多的研究證據(jù)表明植物源miRNAs可以跨越物種，在人體中起到某種調(diào)節(jié)作用。例如在乳腺癌細(xì)胞中，合成的miR 159 模擬物可以通過靶向編碼Wnt信號轉(zhuǎn)錄因子的TCF7而抑制癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致MYC 蛋白水平下降，而通過口服miR 159 模擬物能明顯抑制小鼠異種移植乳腺腫瘤的生長[31]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對于利用攜帶特定miRNA 的中藥外泌體預(yù)防和治療腫瘤來說也是一個(gè)新的契機(jī)。

3.5 其他

除上述藥理作用外，藥用植物外泌體及其miRNA還具有免疫調(diào)節(jié)、降脂等作用。如邵紅偉教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)甘草的miRNA 對人免疫細(xì)胞的基因表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠顯著抑制T 細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，以及炎癥和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[46]。水稻中富含的miR168a 能與人/小鼠低密度脂蛋白受體適配器蛋白1（LDLRAP 1）mRNA 結(jié)合，降低低密度脂蛋白從小鼠血漿中的去除率[34]，此發(fā)現(xiàn)也證明了植物源miRNAs 可以調(diào)控哺乳動(dòng)物靶基因的表達(dá)。此外，研究人員在人乳中也發(fā)現(xiàn)含有植物源miRNAs，并揭示其可能會對嬰兒有機(jī)體中幾條重要的生物途徑起到重要作用[5]。

總之，各種研究表明，藥用植物外泌體中的miRNA 確實(shí)具有跨界調(diào)控其他物種基因的能力，同時(shí)可以被穩(wěn)定吸收進(jìn)入體內(nèi)而發(fā)揮其特異性的藥理作用。更重要的是，藥用植物miRNA 也為植物藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種新的研究思路和方法。

4 外泌體作為藥物載體的應(yīng)用

核酸治療被認(rèn)為是可以靶向調(diào)控并有效抑制疾病相關(guān)基因表達(dá)的治療方法，但是由于核酸藥物在遞送方面的問題，其在臨床上的應(yīng)用受到了許多限制。外泌體的出現(xiàn)則可以解決這一問題。研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以保護(hù)miRNA 在超聲、高溫以及RNase 處理下的完整性[9]，此外，還可以保護(hù)其免受強(qiáng)酸的腐蝕，使miRNA 能夠在人體血液中穩(wěn)定存在[34]，并對人類某些特定基因的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。重要的是由于其具有靶向遞送、低免疫且分布廣的特征，因此采用外泌體作為藥物傳遞系統(tǒng)的載體，是克服易降解，跨膜能力有限以及可能引起免疫反應(yīng)等問題的有效方法[47]。

相比較直接采用藥用植物外泌體作為載體的研究報(bào)道，以動(dòng)物細(xì)胞外泌體為載體，運(yùn)送藥物到指定器官的研究要更為充足。例如腫瘤，其治療需要具有低免疫原性和毒性的靶向給藥載體[48]，以巨噬細(xì)胞外泌體裝載紫杉治療肺癌就起到了較好的效果[49]。此外，錦州醫(yī)學(xué)院用巨噬細(xì)胞外泌體攜帶姜黃素來緩解阿爾茨海默癥（AD）這一嘗試也取得了一定的成功，較好地緩解了AD 鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力障礙[29]。盡管如此，對于用藥用植物外泌體作為載體的研究也在逐漸顯現(xiàn)，例如蔣澄宇教授的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)紅景天湯劑中的小RNA HJT-sRNA-m7 具有強(qiáng)大的抗纖維化作用[14]，隨后利用從紅景天湯劑中提取的外泌體（湯劑體）給小鼠灌胃，表現(xiàn)出極佳的抗纖維化作用。此外，利用HJT-sRNA-m7 和鞘氨醇人工合成了本草體，通過給肺纖維化模型小鼠灌胃，也顯出良好的抗肺纖維化效果[13]。由此可見蔣澄宇教授研究團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了藥用植物外泌體及miRNA 可以通過口服方式，跨物種靶向調(diào)控疾病相關(guān)基因的表達(dá)，該發(fā)現(xiàn)也為藥物載體的后起之秀---外泌體給予了肯定。

5 展望

目前，外泌體的研究大多集中在動(dòng)物細(xì)胞外泌體，如來源于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外泌體，其含有HIF-1α穩(wěn)定性lncRNA，可以調(diào)控乳腺癌的有氧糖酵解[50]；來源于橫紋肌肉瘤(RMS)的細(xì)胞外泌體，對受體RMS 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖有積極的作用[51]；各種研究都在致力于尋找更好的治療策略以解決各種困擾人類已久的腫瘤、癌癥等疑難雜癥，并且也確實(shí)取到了可觀的效果。然而，與中藥相關(guān)的植物外泌體研究甚少，中藥傳承千年，經(jīng)久不衰，在一些疑難雜癥上也有著獨(dú)特的效果。目前，一些中藥植物外泌體及其小RNA 所起的藥理作用機(jī)制尚不明確，所以對中藥植物外泌體及其小RNA 研究也是極其重要的。從近期的研究來看，中藥植物外泌體確實(shí)具有一定的治療作用，其含有的miRNA 可以利用外泌體為載體跨界調(diào)控其他物種基因的表達(dá)，以達(dá)到抗炎、抗病毒、抗纖維化、抗腫瘤等作用，但目前還有一些研究者保持懷疑的態(tài)度。究其原因，現(xiàn)今所證明的中藥種類還比較少，不具有廣泛性，在證實(shí)人體內(nèi)所含有的某些miRNA確實(shí)來自食用的植物藥，而非其他因素引起某種miRNA的增加的證據(jù)仍略有不足，還有待繼續(xù)研究。

總之，中藥植物外泌體及其miRNA 的相關(guān)研究為中藥活性成分的研究提供了一個(gè)新的研究思路[52]，對中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究時(shí)也將不僅僅局限于次生代謝產(chǎn)物，可以擴(kuò)展到核酸等大分子代謝物。同時(shí)，這對中藥的基源鑒定、質(zhì)量控制、新藥開發(fā)等來說也是未來發(fā)展的一個(gè)新的研究方向。同時(shí)明確中藥植物外泌體的治療作用，探索針對疾病治療的關(guān)鍵小RNA，這對中藥的未來發(fā)展也具有極其重要的價(jià)值。