何首烏對(duì)腫瘤脂代謝的影響＊

李洪亮，劉 明，汪選斌＊＊

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬人民醫(yī)院腫瘤中心中藥藥理實(shí)驗(yàn)室 441000；2. 生物醫(yī)藥研究院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北 十堰 442000；3. 西安交通大學(xué)藥學(xué)院 西安 710061）

惡性腫瘤是世界性難治性慢性病[1]。具有死亡率高、復(fù)發(fā)率高、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，目前的手術(shù)切除、化療、放療，乃至免疫療法等仍無(wú)法使其徹底治愈。從中藥藥理學(xué)規(guī)范研究的角度，針對(duì)腫瘤生物學(xué)特征（hallmark）靶點(diǎn)的研究可以較好地總結(jié)、歸納抗腫瘤的藥理機(jī)制[2]。脂代謝異常是hallmark 其中之一。由于腫瘤細(xì)胞快速增殖，為保證能量供應(yīng)，在腫瘤組織中對(duì)脂質(zhì)合成、去飽和化和轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)增加[3]，并通過(guò)相關(guān)的通路對(duì)腫瘤的增殖和死亡[4]、血管生成、侵襲、遷移造成影響[5]。近年來(lái)中藥抗腫瘤脂代謝受到關(guān)注。

蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）是常見(jiàn)的補(bǔ)益類中藥[6]，也是道教醫(yī)藥中常用的補(bǔ)益方藥[7]，東漢時(shí)期被稱為馬肝石，以干燥塊根入藥。唐朝李翱在《何首烏傳》中記載了有位叫何首烏的人，祖上信奉道教，“生而閹弱，年五十八，無(wú)妻子，常慕道術(shù)，隨師在山”，偶然得藥用之，不僅所有疾病皆無(wú)，頭發(fā)還變黑，祖孫壽命皆過(guò)百，后人便以其孫之名把這種藤能“夜交”的藥稱為何首烏[8]。《中國(guó)藥典》中記載何首烏（Polygoni Multiflori Radix）有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便之功效，制首烏（Polygoni Multiflori Radix Praeparata.）可補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)何首烏、制首烏主要藥理作用近似，可用于神經(jīng)保護(hù)、抗衰老、心肌保護(hù)、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化、保肝致瀉、抗菌、促進(jìn)造血功能，以及具有抗腫瘤作用[10]。臨床組方可用于肝癌、腦瘤、甲狀腺癌、白血病[6,11]。本文試結(jié)合本課題組近年來(lái)建立的基于腫瘤生物學(xué)特征的抗腫瘤中藥藥理學(xué)篩選技術(shù)平臺(tái)，對(duì)何首烏抗腫瘤脂代謝進(jìn)行回顧，為進(jìn)一步開發(fā)何首烏的抗癌活性和臨床應(yīng)用提供參考。

1 基于腫瘤生物學(xué)特征的抗腫瘤中藥藥理學(xué)篩選技術(shù)平臺(tái)建設(shè)與何首烏抗腫瘤細(xì)胞能量代謝失衡

腫瘤發(fā)病機(jī)制差異很大，即使同一器官的腫瘤，如肺癌中有小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，后者又包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌[12-13]；乳腺癌按分子分型，可分為：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2+型和Basal-like型[14]。其診治完全各異。提示針對(duì)其特定的分子靶點(diǎn)開展研究，是中藥藥理學(xué)規(guī)范研究要點(diǎn)。因此，基于Hanahan在Cell上腫瘤生物學(xué)特征的經(jīng)典分類[15]，我們將中藥抗腫瘤學(xué)藥理學(xué)研究根據(jù)分子靶點(diǎn)機(jī)制分為了11 類，并逐步建立相應(yīng)的規(guī)范研究技術(shù)平臺(tái)[2,16-21]。我們總結(jié)發(fā)現(xiàn)，何首烏可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、組滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抗血管新生[22]、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤干細(xì)胞[6,23]。但這些作用是否之間存在相互作用或干擾（cross-talk）尚不清楚。

腫瘤的細(xì)胞能量代謝失衡（deregulating cellular energetics）是腫瘤生物學(xué)特征之一，包括糖代謝異常和脂肪代謝異常[15]。腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常主要是對(duì)糖的攝取[24]和有氧糖酵解（Warburg 效應(yīng)）[25]。有文獻(xiàn)報(bào)道何首烏中有效成分二苯乙烯苷對(duì)肝臟糖代謝有影響，可減輕糖尿病模型大鼠和小鼠腎損傷（包括對(duì)30 mmol/L 高糖環(huán)境足細(xì)胞的氧化損傷）[26-28]，改善胃腸動(dòng)力[29]，目前沒(méi)有二苯乙烯苷對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝的影響報(bào)道。另一方面，我們總結(jié)發(fā)現(xiàn)，何首烏能夠減輕非酒精性脂肪肝、抗肝氧化、肝纖維化、肝硬化和肝癌，可用于高脂血癥[30]。并且大黃素、大黃酚（何首烏中含有的蒽醌類成分）對(duì)腫瘤脂代謝可能有作用[31-32]，但機(jī)制尚不清楚，這些引起了我們的興趣。

2 何首烏抗腫瘤脂代謝的機(jī)制

腫瘤的新生脂肪（de novo lipogenesis）與肝癌脂代謝中的重要轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）關(guān)系密切，SREBP1 在多種腫瘤中高表達(dá)，并通過(guò)影響下游的脂肪酸代謝相關(guān)因子參與了腫瘤的脂肪代謝。如通過(guò)乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACACA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）、ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACLY）等，促進(jìn)脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）與甘油三酯（tryglyceride，TG）的合成；通過(guò)促進(jìn)硬脂酰CoA 去飽和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD1）的轉(zhuǎn)錄，使脂肪酸去飽和化；通過(guò)影響下游脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty acid-binding protein3/7，F(xiàn)ABP3/7），影響FA 的轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。何首烏是否干預(yù)了腫瘤的脂代謝，是否與上述途徑有關(guān)是我們需要研究的方向。由于制何首烏具有補(bǔ)肝腎之功效，結(jié)合前期工作，我們選用制何首烏醇提物作用于肝癌細(xì)胞來(lái)研究其抗癌活性。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏醇提物可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并使肝癌細(xì)胞線粒體膜電位下降，從而誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞內(nèi)源性凋亡。進(jìn)一步又發(fā)現(xiàn)制何首烏醇提物干擾了肝癌細(xì)胞的FA 去飽和化，使肝癌細(xì)胞的不飽和酸亞油酸和棕櫚油酸與其對(duì)應(yīng)的飽和脂肪酸硬脂酸和棕櫚酸比例下調(diào)，提示制何首烏醇提物干擾肝癌細(xì)胞FA 的去飽和化與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能有關(guān)；FA的去飽和化依賴于SCD1的活性，其上游正是SREBP1。于是我們有檢測(cè)了制何首烏醇提物對(duì)肝癌細(xì)胞SREBP1 和SCD1 的影響，發(fā)現(xiàn)二者RNA 和蛋白表達(dá)水平均下降，與我們的推測(cè)一致，即：SREBP1 可介導(dǎo)下游多種脂代謝信號(hào)的轉(zhuǎn)錄，其中包括SCD1[34]，SCD1 是一種錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酶，可催化飽和FA 如硬脂酸、棕櫚酸去飽和化變成不飽和的亞油酸和棕櫚油酸，亞油酸和棕櫚油酸則在長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶（long-chain fatty-acyl elongase，ELOVL）的作用下，轉(zhuǎn)化為其它不飽和酸而為細(xì)胞存活提供支持[35-36]。而硬脂酸、棕櫚酸去飽和化受阻可能導(dǎo)致FA 堆積和不平衡[35,37-38]，誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)制何首烏醇提物通過(guò)抑制SREBP1的轉(zhuǎn)錄活性而降低肝癌細(xì)胞的脂代謝，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)源性凋亡[39]。但制何首烏醇提物中何種成分發(fā)揮了作用，不得而知。

3 何首烏抗腫瘤脂代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)

我們?cè)谇捌谖墨I(xiàn)復(fù)習(xí)中，發(fā)現(xiàn)何首烏主要的抗癌活性成分包括二苯乙烯類成分如二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）和白藜蘆醇（resveratrol）；蒽醌類成分如大黃素（1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone，emodin），蘆薈大黃素（aloe-emodin），大黃酚（chrysophanol），大黃素甲醚（physcion），大黃酸（rhein），大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucoside），大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（physcion-8-O-β-D- glucoside），鞣質(zhì)類（tannins）等[6,11]。TSG 在何首烏中含量很高，但其抗腫瘤作用報(bào)道不多，顧民華等[40]報(bào)道它能增加肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TSG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制濃度大于1 000 μM（數(shù)據(jù)未發(fā)表）時(shí)單獨(dú)抗腫瘤作用研究?jī)r(jià)值不大。而大黃素等蒽醌類化合物抗癌活性報(bào)道較多[30]，文獻(xiàn)報(bào)道何首烏中有蒽醌類成分22 種[41-42]。我們選取了6 種常見(jiàn)的化合物：大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚，進(jìn)行抗腫瘤脂代謝的篩選。以MTT 法檢測(cè)了6 種蒽醌類化合物對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402 的增殖，并檢測(cè)了對(duì)SREBP1 的mRNA 和蛋白的表達(dá)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6 種蒽醌類成分對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用順序大小依次為：大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚。其中IC50值小于400 μM 的有大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚；對(duì)SREBP1 的mRNA 和蛋白表達(dá)有抑制作用的是大黃素、大黃酸和大黃素甲醚[43]。大黃酚對(duì)肝癌細(xì)胞SREBP1 無(wú)抑制作用，這與Li 等人報(bào)道的大黃酚可通過(guò)抑制SREBPs 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞Huh-7 脂代謝的結(jié)果不一致[32]，這可能是因?yàn)榧?xì)胞系的不同以及實(shí)驗(yàn)室間差異。由于大黃素在何首烏蒽醌類成分中含量最高[44]，且Lee 等人報(bào)道它對(duì)腫瘤細(xì)胞的FA 合成有抑制作用[31]，因此，我們選用大黃素為代表，研究何首烏抗腫瘤脂代謝的主要活性及其作用機(jī)制。

大黃素，除何首烏外，還存在于其它蓼科植物如大黃、虎杖和豆科決明子等植物中[16]。它能抑制腫瘤細(xì)胞周期因子D（Cyclin D）和細(xì)胞周期因子E（Cyclin E）[45]，周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）[46]；通過(guò)激活胞外凋亡因子fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)ASL）[47]、細(xì)胞色素C（cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-9）和凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）[48]，降低細(xì)胞膜電位（membrance potential）[49]而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[50]；通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以 及Wnt/β-Catenin 通路抑制遷移和侵襲；通過(guò)抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein 1，MRP-1）而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[51]；通過(guò)抑制FA 合成而抑制腫瘤脂代謝[31]。此外，大黃素還可以同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡[52]。因此，我們首先檢測(cè)了大黃素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)它能夠降低細(xì)胞的膜電位，誘導(dǎo)Caspase 依賴的和非依賴的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。通過(guò)檢測(cè)TG和總膽固醇（total cholesterol，TC），以及亞油酸/硬脂酸、棕櫚油酸/棕櫚酸的比例，發(fā)現(xiàn)大黃素可以使TG、TC 合成減少，并減少了硬脂酸和棕櫚酸的去飽和化，同時(shí)qPCR 和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大黃素使肝癌細(xì)胞的脂肪酸合成酶ACLY、ACACA、FASN以及SCD1表達(dá)減少，同時(shí)SREBP1也受到抑制。此結(jié)果與上述制何首烏醇提物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制機(jī)制近似，提示制何首烏醇提物中主要降脂抗癌活性物質(zhì)有大黃素。為進(jìn)一步驗(yàn)證SREBP1在大黃素抗腫瘤脂代謝中的作用，我們又建立了SREBP1 過(guò)表達(dá)（SREBP1-OE）和敲除（SREBP1-KO）細(xì)胞株，與大黃素作用進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)有趣的是，大黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用和對(duì)脂代謝的抑制作用雖然與SREBP1敲除的結(jié)果類似，但大黃素的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SREBP1敲除的結(jié)果。提示大黃素是通過(guò)SREBP1依賴和非依賴的途徑誘導(dǎo)了內(nèi)源性凋亡[53]。結(jié)合Lee 等人有關(guān)大黃素可抑制FASN 的報(bào)道[31]，我們推測(cè)大黃素可能同時(shí)激活了內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，其中內(nèi)源性凋亡途徑與抑制脂代謝有關(guān)。此外，制何首烏醇提物及大黃素不僅僅通過(guò)抑制SREBP1 而誘導(dǎo)凋亡，或者換言之，單純敲除SREBP1并不能使腫瘤細(xì)胞過(guò)度凋亡，提示腫瘤細(xì)胞的脂代謝只是能量代謝、生存的一種途徑而不是主要途徑[54-56]。這一結(jié)果從腫瘤的耐藥和難治性考慮有一定的意義。一方面，單純抑制腫瘤的SREBP1 途徑只能控制細(xì)胞增殖而不能完全殺滅腫瘤細(xì)胞，可能導(dǎo)致耐藥；另一方面，目前有些化療病人無(wú)法耐受甚至死于化療不當(dāng)[57]，遠(yuǎn)不及帶瘤生存、提高病人生存質(zhì)量收益更大。

4 展望與結(jié)語(yǔ)

早期研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞及組織中FA、磷脂（phospholipid）高于正常組織，F(xiàn)A 的合成異常升高，這與脂質(zhì)合成的FASN 調(diào)控密切相關(guān)[3]。FASN 抑制劑在HER2/neu 轉(zhuǎn)基因小鼠中被證實(shí)有效[58-60]。脂質(zhì)合成其他酶包括ACACA、SCD1[60-62]等，受到抑制后也可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。作為第二信使的磷酸肌醇（inositol phosphate）、溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）等，通過(guò)激活下游信號(hào)蛋白增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和存活[63]。近年來(lái)研究還表明作為脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP1異常表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[64-66]，提示SREBP1是中藥抗腫瘤脂代謝的重要靶點(diǎn)。

腫瘤防治是個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，中醫(yī)藥在防治腫瘤上發(fā)揮著一定的作用。以何首烏為例，我們發(fā)現(xiàn)它有抑制腫瘤的脂代謝的作用，機(jī)制與抑制SREBP1 通路有關(guān)。但同時(shí)，它還有SREBP1 非依賴性的誘導(dǎo)凋亡通路。由于何首烏中成分復(fù)雜，抗腫瘤活性成分以蒽醌類為主，但蒽醌類成分作用強(qiáng)弱卻不一樣，，提示中藥抗腫瘤存在多成分、多靶點(diǎn)、多途徑。展望下一步工作，一是包括抑制脂代謝在內(nèi)的何首烏抑制腫瘤作用與機(jī)制到底如何，需要進(jìn)一步研究；二是活性成分對(duì)脂代謝SREBP1 的作用有強(qiáng)有弱、有的甚至沒(méi)有。我們?cè)趯?duì)6 種常見(jiàn)的化合物大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚，進(jìn)行抗肝癌Bel-7402 細(xì)胞脂代謝的篩選中，發(fā)現(xiàn)48h內(nèi)IC50值小于400 μM 的有大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚。其中小于或等于100 μM 有大黃素和大黃酸[42]。而我們用制何首烏醇提物（對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞24 h 的IC50值約400 μg/mL）中游離蒽醌類含量（以大黃素和大黃素甲醚計(jì)）為0.1%[38]，若全部以大黃素計(jì)，制何首烏醇提物中大黃素（分子量270.24）折合成摩爾濃度為：1.48 μM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大黃素的IC50值。但制何首烏醇提物與單純的活性成分大黃素作用強(qiáng)弱相似，是實(shí)驗(yàn)誤差問(wèn)題，還是成分之間的相互作用?有些成分即使沒(méi)有作用，但是否有促進(jìn)其它成分活性的可能性?是增強(qiáng)作用（potentiation），還是中藥多組分的疊加作用（additive effect of multiple compounds of TCMs）[67]?此外，我們前期總結(jié)發(fā)現(xiàn)蒽醌類成分也存在于其它植物如大黃、決明、虎杖等。其含量也不盡相同，其中大黃素在何首烏中含量為0～1.52%，比其它植物相對(duì)高[23]，結(jié)合何首烏及其活性成分對(duì)肝癌脂代謝的影響各異，深入研究何首烏中蒽醌類成分降脂抗癌活性及其成分之間相互作用，有一定意義。

研究抗腫瘤中藥的另一個(gè)重要問(wèn)題就是抗腫瘤中藥技術(shù)方法的規(guī)范性問(wèn)題。具體到何首烏抗腫瘤研究的問(wèn)題，市售何首烏質(zhì)量不一，生首烏和制首烏由于來(lái)源不同、產(chǎn)地不同，采收季節(jié)不同、炮制加工不同其質(zhì)量會(huì)有不同[68-69]。因此，研究何首烏首要的工作是質(zhì)量控制。此外，藥理學(xué)機(jī)制研究需基于某一公認(rèn)度高的靶點(diǎn)或機(jī)制分類方法，并以此建立技術(shù)平臺(tái)[2]。何首烏的抗腫瘤機(jī)制研究正是我們建立了基于腫瘤生物學(xué)特征的篩選平臺(tái)，從腫瘤的細(xì)胞能量代謝失衡入手，發(fā)現(xiàn)了其抑制脂代謝的機(jī)制（Fig 1）。

Fig 1 針對(duì)腫瘤生物學(xué)特征的何首烏抗脂代謝研究思路與技術(shù)路線。實(shí)線為本課題組研究發(fā)現(xiàn)。虛線為可能存在的其它途徑。