調心補腎方改善Presenilin1/2條件性雙基因敲除小鼠記憶障礙的機制研究＊

王迪霖，郎韞哲，袁 見，陳昕昀，李 坤，王俐君，王 健＊＊，徐 穎＊＊

（1. 上海中醫藥大學基礎醫學院 上海 201203；2. 上海中醫藥大學康復醫學院 上海 201203）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）又稱老年癡呆，是一種進行性發展的神經系統退行性疾病，多發于老年人。患者主要臨床表現為記憶力逐漸減退、認知功能發生障礙、行為異常和社交障礙等[1]。近年來，我國AD 的發病率與死亡率日益上升，也得到了社會的廣泛關注。

目前AD 的發生機制并不十分清楚，國際上也存在眾多假說，如淀粉樣蛋白假說、Tau 假說、神經炎癥假說、神經元丟失等假說。其主要病理特征為大腦中Aβ 聚集形成的老年斑、過度磷酸化的tau 蛋白聚集而成的神經元纖維纏結（NFTs）、長期炎性反應以及神經元死亡等[2,3]。

而中醫對AD 的治療方法更側重于從整體出發，并且中藥具有多靶點、多系統、多環節、多途徑作用在研究老年癡呆疾病方面表現出獨特的優勢[4]。建立在唐代孫思邈《備急千金要方》中益智健腦之代表方“開心散”基礎上的“調心補腎方”方藥組成包括黨參、石菖蒲、遠志、茯苓、丹參、肉蓯蓉、枸杞子。具有安神解郁、提高記憶力、增強免疫力的作用。

我們利用Presenilin1/2 條件性雙基因敲除（presenilin1/2 conditional double knockout mice, PS cDKO）小鼠作為AD 模式小鼠，從行為學與生化指標評價“調心補腎方”對PS cDKO 小鼠學習記憶能力的影響，為進一步探索功效物質基礎與新藥開發提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF 級PS cDKO 及其同窩野生型小鼠，共60 只，3-3.5月齡，體重27±5 g，雌雄各半，在上海中醫藥大學實驗動物中心飼養，溫度控制在21±2℃，濕度45%-65%，12 h︰12 h 明暗交替。實驗操作均嚴格按照實驗動物倫理學相關規則進行，經上海中醫藥大學動物倫理委員會批準（審批號：SZY 201707015）。

1.1.2 實驗設備、藥物及主要試劑

行為學記錄儀（荷蘭Noldus Information Technology公司，型號：EthoVision XT），電泳儀（美國BIO RAD，型號：BR90518）；全自動凝膠成像系統（上海天能公司，型號：Tanon-4200SF）；熒光可視顯微鏡（德國Carl Zeiss，型號：Axio Imager 2）；RIPA 裂解液（批號：090717170930）購自碧云天生物技術公司；脫脂奶粉（批號：6A310420）購自Amresco 公司；BSA（批號：6531010160）購自Genview 公司；ECL 顯影液（批號：SD246946）購自Thermo Scientific 公司；DAB（貨號：D5637-5 G）購自Sigma-Aldrich 公司；Triton X-100（批號：20121211）購自國藥集團化學試劑有限公司；孵辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（批號：K187712C）購自中杉金橋公司。調心補腎方購自上海中醫藥大學附屬龍華醫院，為配方顆粒（黨參1.2 g、石菖蒲1.2 g、遠志1.2 g、茯苓1.2 g、丹參1.2 g、枸杞子1.2 g、肉蓯蓉1.2 g）。

使用的抗體信息如下：

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與治療方法

60 只3～3.5 月齡的SPF 級PS cDKO 小鼠及其同窩野生型小鼠按照隨機分為3 組：野生型組（WT，n=20）、PS cDKO 組（cDKO，n= 20）及PS cDKO 加藥組（cDKO+TXBSF，n=20）；根據“人與動物體表面積換算 法”，cDKO + TXBSF 組 食 用 含 有TXBSF（17913 ppm）的飼料，其余兩組食用普通飼料。60 d 后進行行為學檢測，之后進行腦組織取材，通過Western blot 等方法進行檢測。

1.2.2 曠場實驗

長寬高分別為為38 cm×38 cm×25 cm 的曠場箱頂部開放，內面呈白色。設置寬9 cm 設置為邊緣區域。頂部正上方放置攝像頭。實驗前用手安撫小鼠，實驗時將小鼠輕輕放入曠場箱的正中間任其自由活動，由電腦和攝像頭記錄數據，15 min后取出小鼠。用75%的酒精棉球清除小鼠殘留的糞便及尿液，待酒精揮發后進行下一只小鼠的測試。

1.2.3 高架十字迷宮實驗

選取WT、PS cDKO、cDKO+TXBSF 組小鼠識別編號后從同側放入高架十字迷宮，面向開放臂。觀察小鼠是否進入封閉區，時間為5 min。記錄實驗結果待分析。實驗結束后用75%的酒精棉球清除小鼠殘留的糞便及尿液，待酒精揮發后進行下一只小鼠的測試。

1.2.4 Y迷宮實驗

Y 迷宮三個臂呈120°角水平布置，三個臂長寬高分別為30 cm × 6 cm × 15 cm。選取WT、PS cDKO、cDKO + TXBSF 組小鼠識別編號后放入Y 迷宮中，一側用擋板檔起。所有小鼠從同側放入，任其自由活動8 min。1 h 后撤去擋板，重復以上步驟記錄小鼠對于原閉合區的敏感程度并記錄實驗結果待分析。實驗結束后用75%的酒精棉球清除小鼠殘留的糞便及尿液，待酒精揮發后進行下一只小鼠的測試。

1.2.5 恐懼實驗

實 驗 分 為：taining，contextual，cued 三 個 階 段。Training 階段：將小鼠置于恐懼實驗箱中，另其自由活動3 min，接下來給予持續28 s和75 db的聲音刺激，后給予2 s 的0.45 mA 的電刺激小鼠足底。記錄30 s 中小鼠除呼吸以外無任何活動的僵直時間（freezing time）。Contextual階段：位于training階段的24 h后，將小鼠放入相同的恐懼實驗箱中，不給予任何聲刺激及電刺激，記錄其在4 min 的內除呼吸以外的僵直狀態時間。Cued 階段：位于Contextual 階段的1 h 后，將小鼠放入另外一個環境不同的恐懼箱中，不給予任何刺激，觀察記錄其在3 min 內的僵直時間，再給予與Training 階段相同的聲音刺激后記錄3 min 中小鼠的僵直時間。實驗結束后用75%的酒精棉球清除小鼠殘留的糞便及尿液，待酒精揮發后進行下一只小鼠的測試。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達

各組小鼠用20%水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，用預冷的PBS 沖洗一遍后，快速剝離出海馬組織，將其置于凍存管放于液氮中，后放入-80℃冰箱保存備用。

在使用時，取出組織標本50 mg-80 mg，加入400 ul 的裂解液，研磨60 s 后提取出總蛋白，12000 rpm 離心15 min 后，取上清液即為總蛋白。采用BCA 法進行蛋白定量，制成1 mg·mL-1蛋白標準品，在-20℃下保存。將蛋白標準品用0.01 M PBS 梯度稀釋后，每個濃度取20 μl 加入到96 孔板中，并制作標準曲線。將樣本也使用同樣方法稀釋50倍，毎孔20 μl總體積，每組做三個復孔。各孔加入200 μl BCA 工作液，37℃隔水式恒溫培養箱放置30 min，使用酶標儀562 nm 測定吸光度，并根據標準曲線計算出樣品蛋白濃度。將樣品與5×Loading buffer 按比例混合均勻后并變性，室溫冷卻后進行上樣，上樣量為10 μl/40 μg 蛋白。將各不同組別的蛋白樣品加入到電泳槽中相應泳道電泳，先后用60 V 及80 V 恒壓電泳各0.5 h 后用100 V 恒壓直至溴酚蘭遷移至分離膠底部后停止，取出凝膠并放置在轉膜緩沖液中。其后進行轉膜，將凝膠切成適當大小，NC 膜、濾紙和海綿墊均浸泡在轉膜緩沖液中。于110 V 恒壓轉膜2 h，后將蛋白轉至NC 膜上。經過封閉及一抗、二抗孵育及顯色后，在膜上滴加混勻的ECL 顯色劑，用凝膠成像儀采集圖像并讀取數據。用Image J 軟件分析目的蛋白光密度與內參蛋白的光密度。

1.2.7 免疫組化染色方法

小鼠用麻醉后進行4%多聚甲醛心臟灌注后取腦，用4%多聚甲醛后固定和蔗糖溶液梯度脫水后進行OCT 包埋，保存于-80℃。包埋后用冰凍切片機將腦組織切成20 μm厚的冠狀面腦片。將挑選好的腦片用PBS 溶液洗10 min 后，用PBS、甲醇和3% H2O2的混合液（比例為5∶4∶1）孵育30 min。接下來用0.1%Triton X-100（溶于PBS）孵育10 min 透膜。用PBS 洗3次（每次10min）后用1% BSA 室溫封閉2 h，之后孵一抗4℃過夜。PBS 洗3 次（每次10 min）后孵二抗，孵育2 h。PBS 洗3次（每次10 min）后孵辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min。PBS 洗3 次（每次10 min）后用0.05% DAB 孵育，待腦片顯色后用PBS 洗3次后貼片，過夜晾干。用二甲苯透明和乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，最后用顯微鏡觀察，在高倍鏡下拍攝小膠質細胞的形態。

圖1 TXBSF對PS cDKO小鼠運動能力的影響

圖2 TXBSF 對PS cDKO小鼠焦慮樣行為的影響

1.3 統計學方法

實驗數據均使用平均值± 標準誤（Mean ± SEM）表示，實驗數據用SPSS 18.0 軟件分析，多組間的比較采用了One-way ANOVA 分析方法，多項間比較用LSD檢驗，使用Graphpad Prism 7 制圖。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 TXBSF不影響PS cDKO小鼠運動能力

曠場實驗主要是反應實驗動物的自發運動能力和緊張焦慮狀況。由圖1 可知，PS cDKO 小鼠的運動距離比WT 組小鼠明顯增加（P＜0.05），而cDKO +TXBSF 小鼠的運動距離與PS cDKO 小鼠沒有顯著性差異，說明TXBSF 并不會影響PS cDKO 小鼠的自發運動能力；同時，3組小鼠在邊緣區域的時間百分比并沒有顯著性差異。

2.2 TXBSF改善PS cDKO小鼠的焦慮樣行為

高架十字迷宮實驗通過測試動物進入開放臂及封閉臂的次數及時間，以及在開放臂和封閉臂探索的時間占總測試時間的百分比對小鼠的焦慮狀態進行評價。由圖2可知，PS cDKO組小鼠較WT小鼠在開放臂逗留的頻率是降低的（P＜0.01），時間相比是增高的（P＜0.001），cDKO + TXBSF 組的小鼠較PS cDKO組小鼠在開放臂逗留的頻率是增加的（P＜0.01），時間是減少的（P＜0.05），并且具有統計學意義。說明TXBSF能改善PS cDKO小鼠的焦慮樣行為。

2.3 TXBSF改善PS cDKO小鼠的空間記憶障礙

Y 迷宮主要用于研究嚙齒類動物空間工作記憶，其完全是利用實驗動物對新異環境探索的天性，由于動物每次轉換探索方向時都需要記住前一次探索過的方向，因此Y 型迷宮實驗能夠有效地測定動物的空間工作能力。由圖3可知，PS cDKO小鼠較WT組小鼠在閉合臂逗留的頻率和時間相比是降低的（P＜0.01），而cDKO+TXBSF 小鼠在閉合臂逗留的時間和頻率較PS cDKO 小鼠是增加的（P＜0.01），并且具有統計學意義。說明TXBSF 能改善PS cDKO 小鼠空間學習記憶能力。

2.4 TXBSF改善PS cDKO小鼠聯合記憶能力

恐懼實驗可以檢測與小鼠的聯合記憶能力。實驗結果顯示Training 階段3 組小鼠的僵直時間百分比均較低。Contextual 階段及Cued 階段，PS cDKO 小鼠的僵直時間百分明顯低于WT 組（P＜0.001），且cDKO+ TXBSF 小鼠的僵直時間百分比PS cDKO 小鼠高（P＜0.05）(圖4）。由此說明，TXBSF 可以改善PS cDKO小鼠的聯合記憶能力。

圖3 TXBSF對PS cDKO小鼠空間記憶障礙的影響

圖4 TXBSF對PScDKO小鼠聯合記憶能力的影響

2.5 TXBSF 降低PS cDKO 小鼠海馬組織中促炎癥因子iNOS和COX-2蛋白表達

Western blot 的檢測結果顯示，海馬組織促炎癥因子誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和環氧合酶2（cycloxygenase-2, COX-2）的蛋白表達水平在PS cDKO 小鼠較WT 小鼠是升高的（P＜0.001），而cDKO + TXBSF 小鼠較PS cDKO 小鼠是降低的（P＜0.01，P＜0.05，），TXBSF 降低了PS cDKO 小鼠海馬組織中促炎癥因子iNOS 和COX-2 的蛋白水平（圖5）。

圖5 TXBSF對PS cDKO小鼠海馬組織中iNOS和COX-2表達的影響

2.6 TXBSF 提高PS cDKO 小鼠海馬組織中突觸蛋白MAP2和PSD95的表達

與神經元突觸功能相關的微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2, MAP2）以及突觸后致密蛋白95（Postsynaptic dlensity 95, PSD95）在PS cDKO 小鼠海馬中的表達較WT小鼠水平下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001），而此兩種蛋白表達在cDKO + TXBSF 小鼠較PS cDKO 小鼠是升高的，且有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001）（圖6）。表明TXBSF 改善PS cDKO 小鼠海馬組織神經元和突觸損傷。

圖6 TXBSF對PS cDKO小鼠海馬組織中MAP2和PSD95蛋白表達的影響

2.7 TXBSF 阻止PS cDKO 小鼠海馬CA3 區小膠質細胞的激活

采用Iba1 抗體進行DAB 免疫染色觀察3 組小鼠海馬CA3 區小膠質細胞的形態變化（圖7)。結果發現，與WT 小鼠相比，PS cDKO 小鼠海馬CA3 區的小膠質細胞呈現出明顯的激活狀態，出現胞體增大，突起回縮的阿米巴樣變化；然而cDKO + TXBSF 小鼠CA3區小膠質細胞的激活現象得到明顯改善。

圖7 TXBSF對PS cDKO小鼠海馬CA3區小膠質細胞形態的影響

3 討論

阿爾茨海默癥作為如今最受關注的神經退行性疾病之一，近年來發病率與死亡率逐年上升。該癥患者會出現一定的學習記憶功能障礙。我們使用PS cDKO 小鼠作為AD 模型，從行為學與生化指標評價“調心補腎方”對動物學習記憶能力的影響。曠場實驗通過攝像頭記錄的小鼠總運動距離與平均速度來判斷它們的自發運動能力，記錄小鼠在邊緣區域的時間百分比來評價它們焦慮狀態和運動能力的一種經典行為學方法[5,6]。實驗結果顯示：PS cDKO小鼠較WT小鼠運動能力高，而TXBSF 不會影響小鼠的運動能力。高架十字迷宮實驗通過測試小鼠進入開放臂及封閉臂的次數及時間以檢測小鼠的焦慮狀態及學習記憶能力[7]。實驗結果顯示PS cDKO 小鼠較WT 小鼠焦慮，TXBSF 能改善這一焦慮癥狀。同時PS cDKO 小鼠在開放臂逗留時間低于WT及cDKO+TXBSF 小鼠，說明TXBSF 能改善PS cDKO 小鼠的焦慮樣行為。Y迷宮實驗根據小鼠傾向于探索新異空間的天性，檢測小鼠對新異臂的空間記憶能力[8]。實驗結果顯示PS cDKO 組小鼠在閉合臂的逗留頻率及時間比均比WT小鼠低，而TXBSF 治療之后，閉合臂逗留頻率及時間比明顯增加。說明TXBSF 能改善PS cDKO 小鼠空間學習記憶能力。條件性恐懼實驗結果顯示小鼠海馬-杏仁核依賴的恐懼記憶能力。在Contextual 階段與Cued 階段，cDKO + TXBSF 組的僵直時間百分比PS cDKO 組明顯增高且，說明TXBSF 可以改善小鼠的對恐懼性時間的記憶能力有改善作用。關于TXBSF 能改善AD 小鼠學習記憶相關的行為學能力的原因，我們推測是因為其調節了小鼠腦組織中某些反映神經元或突觸功能相關蛋白的表達水平；并根據以前研究報道，PS cDKO小鼠腦內神經炎癥反應明顯，我們進一步推測TXBSF 可能通過抑制PS cDKO 小鼠的神經炎癥反應改善神經元突觸功能。相關文獻顯示，促炎癥因子iNOS 可引起NO 自由基的合成，并形成可損傷細胞膜的過氧亞硝酸鹽，導致細胞DNA 堿基損傷，細胞死亡[9]。而COX-2 在體內炎性環境下被誘導表達，廣泛參與體內的炎癥反應[10]。iNOS 和COX-2 引起的炎癥能間接性地對海馬神經元產生損傷。炎癥反應激活的小膠質細胞和星形膠質細胞可能會引起信號通路的改變，導致神經元變性[11]。更有研究證實注射COX-2 抑制劑可顯著減少海馬中的神經炎癥，提示外周炎癥會觸發COX-2 依賴性機制，誘導CNS 神經炎癥[12]。我們對小鼠海馬組織中iNOS 和COX-2 蛋白表達采用Western blot 進行檢測，檢測后發現，TXBSF 可以降低PS cDKO 小鼠海馬組織中iNOS 和COX-2 表達，以及明顯抑制海馬CA3 區小膠質細胞的激活，故表明TXBSF 可起到抑制神經炎癥反應的作用，以減少海馬體內神經元的損傷，改善小鼠的記憶能力。此外TXBSF 提高PS cDKO 小鼠海馬組織中反映突觸功能的MAP2和PSD95的蛋白表達。相關研究顯示，MAP2水平降低，將導致微管解聚，影響軸漿運輸，造成神經元變性[13,14]。而PSD95 蛋白作為突觸前后的主要標志物，在突觸的形成和神經發育過程中起著基本支架蛋白的作用，其表達含量升高意味著神經元突觸的功能得到改善[15-17]。故根據以上實驗結果可知，TXBSF 可能通過抑制PS cDKO 小鼠神經炎癥反應并改善神經元和突觸損傷，從而改善PS cDKO 小鼠的學習記憶能力障礙。

4 結論

中藥方劑TXBSF 能有效改善PS cDKO AD 模型小鼠的空間和聯合學習記憶能力。TXBSF改善PS cDKO小鼠記憶障礙的作用可能是通過降低海馬神經炎癥反應并改善神經元突觸功能而實現的。