越鞠丸對皮質酮體外模型神經元過度自噬的保護作用研究＊

陸林玉，吳 蝶，王 凱，唐娟娟＊＊，陳 剛

（1. 南京中醫藥大學醫學與生命科學學院·整合醫學學院 南京 210023；2. 暨南大學腦病個性化防治跨學科研究所 廣州 510632；3. 神經再生協同創新中心 南通 226001）

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的情感性精神障礙綜合征，因其具有高患病率和高致死率，被稱為“第一心理殺手”。目前臨床首選抗抑郁藥物為5-羥色胺再攝取抑制劑，如氟西汀、舍曲林和帕羅西汀等[1]。然而，這些藥物作用大部分基于單胺類神經遞質失調的假說，且存在副作用大、起效慢和易復發等缺點，這表明單胺類神經遞質失調假說并不能完全闡明抑郁癥的發病機制。因此，探討抑郁癥發病機制，尋找快速起效安全的抗抑郁藥迫在眉睫。

近年來的研究證實，自噬參與抑郁癥的發生發展。自噬是細胞自我降解的過程，通過去除錯誤折疊或聚集的蛋白以及損傷的細胞器減少細胞的壞死和凋亡，維持內環境穩態。自噬在一定限度內是有益的反應，但是在一些疾病過程中，可能出現自噬過度激活的現象。Beclin-1 與LC3 是兩種具有代表性的自噬標志性蛋白，Beclin-1是調控細胞自噬的關鍵因子，是自噬體形成的必要條件，LC3 則參與自噬體膜的形成[2]。重度抑郁癥患者血液中自噬基因表達增加，產前應激小鼠的雄性后代海馬自噬水平升高[3]。抑郁癥患者尸檢發現，前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)突觸蛋白合成受抑制，mTOR 磷酸化水平降低，提示自噬激活[4]。mTOR 是自噬的關鍵調節因子，其絲氨酸2448位點磷酸化后可被激活，繼而磷酸化下游底物，調控自噬相關蛋白。mTOR 通路的異常往往伴隨著自噬障礙。雙相情感障礙患者AKT（Protein kinase B，PKB）和mTOR 的mRNA 表達較健康對照組顯著降低，可能導致自噬的誘導[5]?？焖倨鹦г退幝劝吠軌蛲ㄟ^激活mTOR，抑制自噬，增強突觸可塑性，從而發揮快速抗抑郁作用[6]。

越鞠丸始載于《丹溪心法》，由梔子、蒼術、香附、川芎、神曲組成，是治療郁癥的經典方，對其治療抑郁癥的相關機制研究也多見報道[7-9]。本實驗室前期研究結果表明，在小鼠慢性不可預知應激模型中，越鞠丸醇提物（YJ-E）具有快速持久的抗抑郁作用，其作用靶點為mTOR 信號通路[7]，但是越鞠丸與mTOR 調控的自噬相關性尚不清楚。本實驗旨在皮質酮離體應激模型的基礎上，評價YJ-E 對PC12 細胞的神經保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

越鞠丸由梔子、川芎、蒼術、香附、神曲組成，藥材來自南京國醫堂門診部藥房，皮質酮（CORT）購自

Aladdin，C104537。

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），胰蛋白酶（trypsin，Gibco，10270-106，25200-056）；高糖培養基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM，

Gibco，11995-065）；MTT（Biofrox，298-93-1）；青霉素-鏈 霉 素（Gibco）；磷 酸 鹽緩 沖 液（phosphate buffer saline，PBS，Hyclone，SH30256.01）；二 甲 基 亞 砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，Aladdin，D103272）。

1.2 儀器

SC06AD-2 型恒溫二氧化碳（CO2）培養箱；CX31型熒光倒置顯微鏡（Olympus）；Multiskan FC 型全自動酶標比色儀（Thermo Scientific）；ThermoFisher50137369低溫超速離心機，EPED-E2-10TF 型超純水器，SWCJ-2F 型雙人雙面超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）；TY-80S 型脫色搖床（普陽科學儀器研究所）；蛋白電泳系統，Mini Trans-Blot 轉印槽（Bio-Rad）；5200 系列凝膠成像及分析系統（上海天能科技有限公司），Thermo Nanodrop 2000紫外分光光度計。

1.3 細胞培養

PC12 細胞復蘇后培養（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）于37℃、5% CO2培養箱中，24 h 后更換培養基，取對數生長期的PC12細胞，以5×104個·mL-1的密度，接種于96孔培養板，待細胞完全貼壁后，加入皮質酮濃度梯度為100，200，400 μmol·L-1，繼續培養24 h。

1.4 越鞠丸醇提液（YJ-E）的制備

梔子、蒼術、香附、川芎、神曲各200 g 打粉，過100目篩混勻，加入10 倍量95%乙醇室溫24 h，收集浸出液，重復2 次。過濾浸出液后，55℃條件下減壓濃縮，收集濃縮后浸膏48.4 g，分裝于-20℃保存。將越鞠丸母液（48.4 g·L-1）用DMEM 分別稀釋為0.2，0.4，0.8 mg·mL-1，預給藥30 min 后，皮質酮(200 μmol·L-1)孵育24 h，更換不含血清高糖DMEM 培養液，進行后續實驗。

1.5 MTT法測定細胞存活率

PC12 細胞接種于96 孔板上培養24 h 后更換無血清培養基，隨機分組。YJ-E 預給藥30min，皮質酮孵育24 h，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT 溶液，37℃繼續孵育4 h，吸棄培養基，每孔加入150 μL DMSO，搖床慢搖20 min，570 nm 波長測定各孔光吸收值，并記錄結果。

1.6 Hoechst 染色法

PC12細胞接種于24孔板（2×105mL-1），培養24 h后更換無血清培養基，隨機分組。YJ-E 預給藥30 min后，皮質酮孵育24 h，吸棄培養基，加入終濃度10 μg·mL-1的Hoechst 33342 溶 液（四正柏，FXP138-1000）250 μL，室溫放置15-60 min 后，吸棄染色液，4%多聚甲醛溶液固定20 min。PBS 溶液洗滌細胞3 次，每次10 min。熒光顯微鏡紫外濾光器下觀察細胞核大小及形態。

1.7 Western blotting

PC12 細胞接種于6 孔板（1 × 106mL-1，2 mL/孔），24 h 更換無血清培養基，隨機分組。YJ-E 孵育30 min后加入皮質酮，24 h 后收集細胞，加入50 μL RIPA（Radio-Immunoprecipitation Assay）裂解液，離心取上清，紫外分光光度計測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，300 mA 轉膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF膜）60 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗p-mTOR，mTOR，LC3，Beclin-1 （Cell Signaling Technology，2972S，2971S，4108，3738），Tubulin（proteintech，10094-1-AP）4℃過夜。TBST 漂洗3 次，10 min·次-1，加入二抗羊抗兔-HRP（正能，511203）37℃孵育1 h，TBST 漂洗3 次，10 min·次-1，ECL 顯影（康為世紀生物科技），全自動化學發光圖像分析系統顯影分析。

1.8 統計學處理

數據均用±SEM 表示，采用One-way ANOVA 結合Tukey 多重比較（GraphPad Prism 5.0）分析各組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 0.4 mg·mL-1 YJ-E提高皮質酮模型下PC12細胞的存活率。a.3個濃度的皮質酮（100,200,400 μmol·L-1）均能顯著降低PC12細胞的活性。ANOVA,F（3,33）=20.36,P＜0.0001；b.預給予3個濃度YJ-E（0.2，0.4，0.8 mg·mL-1），其后給予皮質酮200 μmol·L-1,其中0.4 mg·mL-1 YJ-E顯著改善皮質酮誘導的PC12細胞的凋亡，0.2，0.8 mg·mL-1YJ-E不能逆轉PC12細胞的凋亡。ANOVA,F（5,37）=11.06,P＜0.0001；c.Hoechst染色。*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組相比，##P＜0.01，與皮質酮組相比，n=5。

2 結果與分析

2.1 YJ-E改善皮質酮誘導的PC12細胞的凋亡

MTT法結果顯示，給予100 μmol·L-1皮質酮，PC12細胞存活率為82.4%；給予200 μmol·L-1皮質酮，細胞存活率為74.1%；給予400 μmol·L-1皮質酮，細胞存活率為62.5%，三個濃度的皮質酮均能顯著降低PC12 細胞的活力（ANOVA, F（3, 33）=20.36,P＜0.0001）（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）（圖1a），因此選取200 μmol·L-1進行后續實驗。結果表明，皮質酮濃度依賴性的損傷PC12細胞。

預給予3 個濃度的YJ-E（0.2，0.4，0.8 mg·mL-1），其中0.4 mg·mL-1的YJ-E 能夠顯著改善皮質酮模型下PC12 細胞的存活（P＜0.01），0.2，0.8 mg·mL-1的YJ-E均無顯著改善作用。單獨給予0.8 mg·mL-1的YJ-E 對PC12 細胞的存活率無顯著影響（ANOVA, F（5,37）=11.06，P＜0.0001）（圖1b）。因此選取0.4 mg·mL-1YJE進行后續實驗。

Hoechst 染色結果顯示，對照組和單獨給予YJ-E組PC12 細胞核形態呈圓形，淡藍色，內有較深藍色顆粒。皮質酮模型組大部分細胞核濃集呈亮藍色，形態皺縮。預給予YJ-E 組大部分細胞核呈圓形淡藍色，僅少量細胞核皺縮（圖1c）。結果表明，0.4 mg·mL-1YJ-E 顯著改善皮質酮誘導的PC12 細胞凋亡，而0.2，0.8 mg·mL-1的YJ-E無此神經保護作用。

2.2 YJ-E抑制皮質酮誘導的PC12細胞的過度自噬

Western blotting 結果顯示，200 μmol·L-1皮質酮顯著降低mTOR 的磷酸化（P＜0.01），預給予0.4 mg·mL-1YJ-E 逆轉了mTOR 磷酸化水平的降低（P＜0.01）（ANOVA,F（3,8）=11.9，P=0.0026）。同時，皮質酮模型下LC3II/LC3I 和Beclin 的表達增加（P＜0.01,P＜0.01），YJ-E 抑制了LC3II/LC3I 和Beclin 的蛋白表達（P＜0.01，P＜0.05）（ANOVA, F（3,8）= 9.788,P=0.0047；ANOVA，F（3,8）=9.194，P=0.0057）。單獨給予YJ-E 對于mTOR 的磷酸化及LC3II/LC3I，Beclin 的蛋白表達水平無影響（圖2）。結果表明，YJ-E 對皮質酮離體模型下PC12 細胞的神經保護作用機制可能與促進mTOR磷酸化，抑制神經元過度自噬相關。

圖2 YJ-E促進皮質酮離體模型下PC12細胞mTOR的磷酸化，抑制神經元過度自噬。a.Western blotting結果圖示p-mTOR，mTOR,LC3I,LC3II，Beclin和Tubulin的表達；b-d.預給予0.4 mg·mL-1YJ-E，其后給予200 μmol·L-1皮質酮,對PC12細胞mTOR磷酸化水平及LC3，Beclin表達的影響。ANOVA,F（3,8）=11.9,P=0.0026；ANOVA,F（3,8）=9.788,P=0.0047；ANOVA,F（3,8）=9.194,P=0.0057。**P＜0.01，與對照組相比，##P＜0.01，與皮質酮組相比，n=3。

3 討論

抑郁癥與中醫的“郁證”類似，一些解郁的經方已廣泛用于治療抑郁癥，如甘麥大棗湯，梔子厚樸湯，越鞠丸等。本實驗室前期對越鞠丸的研究發現，在小鼠慢性不可預知應激模型（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）中，越鞠丸表現出與氯胺酮類似的快速抗抑郁作用，其作用靶點為NR1（N-methyl-Daspartic acid receptor 1，NMDA 受體1）和Akt/mTOR 信號通路[7]；在慢性注射皮質酮的小鼠抑郁癥模型中，越鞠丸可以激活PKA（protein kinase A，蛋白激酶A）-ERK（extracellular regulated protein kinases，細胞外調節蛋白激酶）-CREB（cAMP response element binding protein，cAMP反應元件結合蛋白）信號通路，增強海馬神經新生，發揮抗抑郁作用[10]。越鞠丸加四君子湯能夠快速增加小鼠海馬中的PACAP 和BDNF 蛋白的表達而產生快速抗抑郁的作用[11]。越鞠丸還可以通過增加Balb/c 小鼠前額皮層的場電位及長時程增強，提高突觸傳遞效能，產生抗抑郁作用[12]。本研究發現：①高濃度皮質酮顯著損傷PC12 細胞，降低其活力，因此本研究在體外模型中模擬了抑郁癥形成過程中皮質酮對神經細胞活力的損傷作用；②0.4 mg·mL-1YJ-E能夠改善皮質酮誘導的PC12 細胞凋亡，而低、高劑量均無此神經保護作用；③YJ-E 顯著增加皮質酮誘導的PC12 細胞mTOR 的磷酸化水平，與CUMS 小鼠模型YJ-E 對前額葉神經細胞的作用相一致；④YJ-E 顯著抑制皮質酮誘導的PC12 細胞自噬相關蛋白LC3II/LC3I 和Beclin 的表達，顯示YJ-E 能夠逆轉此離體模型中神經細胞的過度自噬。

慢性應激能夠引起人類和小鼠糖皮質激素和皮質酮水平升高，而過高的糖皮質激素和皮質酮也是抑郁癥的重要表現之一。高濃度的糖皮質激素和皮質酮能誘發神經元和膠質細胞相關的多種疾病反應，如調亡、自噬和突觸可塑性的改變。因此離體實驗通常采用皮質酮刺激神經元或膠質細胞，模擬抑郁癥的內環境，建立抑郁癥離體模型[13]。自噬是真核細胞中普遍存在的一種現象，在維持細胞、組織和生物體穩態過程中發揮重要作用。在抑郁癥相關的動物模型中，研究發現自噬水平降低的現象。例如，在LPS（Lipopolysaccharides，脂多糖）以及慢性不可預知應激誘導的動物抑郁模型中，自噬標志物表達降低[14,15]。然而，臨床研究發現，與健康對照組相比，患有嚴重抑郁癥的個體血液單核細胞中的自噬基因的表達升高[16]。所以在抑郁癥中，自噬的調節是正向還是負向尚存在爭議[17]。近期研究發現許多抗抑郁藥與自噬通路密切相關[18]，經典自噬誘導劑雷帕霉素通過mTOR通路發揮抗抑郁樣作用[19]，另外金絲桃素[20]、羅格列酮[21]、水飛薊賓[22]和芡實提取物[23]等均能通過增強自噬抗抑郁。因此，自噬是一把雙刃劍。適度的自噬可以將一些損壞的蛋白或細胞器進行降解，并得以循環利用。過度的自噬會導致細胞內代謝紊亂，引起神經元和膠質細胞功能異常甚至凋亡，可能是離體皮質酮模型中神經細胞活力明顯下降的原因之一?？挂钟羲幏魍⊥ㄟ^上調AKT 的磷酸化促進神經發生并改善神經元存活，而PI3K（Phosphoinositide 3-kinase，磷脂酰肌醇三激酶）-AKT-mTOR 信號通路是抑郁癥中調節自噬的重要通路[15]。Warren 等[24]發現，氟西汀和派醋甲酯聯用能夠逆轉SD 大鼠的抑郁樣行為，并增加大鼠腹側被蓋區mTOR、CREB（環磷腺苷效應元件結合蛋白，cAMP-response element binding protein）、ERK（細胞外調節蛋白激酶，extracellular regulated protein kinases）的蛋白表達水平。因此，mTOR 信號通路參與抗抑郁藥的作用機制，其通過促進蛋白質合成誘導神經再生，發揮神經保護作用[25]。Park 等[26]發現西酞普蘭、帕羅西汀與苯環丙胺可以顯著增加mTOR 及其下游分子4E-BP1（真核翻譯起始因子4E 結合蛋白1，Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1）和p70S6K 的磷酸化水平，并增加海馬樹突生長和突觸蛋白水平，這些作用可以被雷帕霉素所抑制。本研究中越鞠丸可以促進皮質酮模型下PC12 細胞mTOR 的磷酸化，其通過mTOR 信號通路調控細胞自噬，保護細胞免受皮質酮的損傷。

微管相關蛋白輕鏈3（LC-3）和Beclin 是自噬相關基因編碼產物，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉化是判斷自噬的指標，而Beclin-1 是自噬必不可少的正向調節因子[27]。因此，本研究通過觀察mTOR 的磷酸化水平以及LC3、Beclin 自噬相關指標，發現：慢性應激可以通過抑制mTOR 磷酸化誘導自噬。適度自噬對維持神經元穩態發揮重要作用，但是持續慢性應激導致腦內皮質酮大量蓄積，誘導神經元內過度自噬，自噬小體積聚，神經元凋亡增加，從而引發抑郁癥。越鞠丸醇提物能夠通過調控mTOR 的磷酸化阻斷神經元內過度自噬，減少自噬小體的形成，在離體抑郁癥模型中發揮神經保護作用（圖3）。

圖3 假說圖：越鞠丸醇提物通過調控mTOR的磷酸化阻斷神經元內過度自噬，減少自噬小體的形成，在離體抑郁癥模型中發揮神經保護作用。

抑郁癥是一種慢性、易復發的精神障礙疾病，近年來越發引起臨床關注。越鞠丸功用行氣解郁,臨床常用于郁證的治療。本研究在前期研究基礎上，建立抑郁癥離體模型，探討了抑郁癥中神經元過度自噬的可能機制，并進一步為臨床應用越鞠丸治療抑郁癥提供了有力證據，也為研發靶向自噬抗抑郁癥藥物提供新的策略。