苯丙酮尿癥質譜篩查和基因診斷分析

陳梅 ，劉清波 ，江寧 ，王偉紅 ，劉靜 ，黃萍 ，孫茂

1.唐山工人醫院婦產科，河北唐山 063000；2.空軍軍醫大學基礎醫學院，陜西西安 710032

苯丙酮尿癥（Phenylketonuria,PKU,OMIM261600）是遺傳代謝病中常見的常染色體隱性遺傳病，上世紀30年代因佛倫醫生(Folling)發現患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名[1]。經過科研人員的研究苯丙酮尿癥的發病機制已經很明確，其中≥90%是由于苯丙氨酸羥化酶（Phenylalaine hydorxylase,PAH）基因突變導致肝臟內酶活性降低或缺乏，≤10%是由于PAH的的輔酶四氫生物蝶呤 （Tetrahydrobiopterin,BH4）缺乏，兩種情況都會造成苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）無法正常轉化為酪氨酸（Tyrosine,Tyr），從而開啟旁路代謝，產生大量的苯丙酮酸，并在體內異常蓄積，導致疾病發生。苯丙酮尿癥其發病率因人群和地域而異，我國發病率約為1/11307[2]。如延誤診治，會造成患者神經系統不可逆損害，嚴重影響神經系統的發育和兒童的智力發育。該文回顧性分析2016年1月—2017年4月，通過該院DNA分型中心篩查的3 593例高危兒中確診的8例苯丙酮尿癥患兒情況，并結合分析了國外和國內的相關文獻進行系統分析，以期加強臨床醫生對苯丙酮尿癥的認識，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次檢測在3 593例高危兒中檢出8例PKU患兒，男3例，女5例，年齡1歲以下6例，8～10歲2例。在新生兒苯丙酮尿癥和先天性甲狀腺功能減低癥篩查中得到PKU異常，進一步通過遺傳代謝篩查（血液氨基酸和酰基肉堿檢測、尿液有機酸檢測）和基因診斷確診苯丙酮尿癥。該研究經醫院醫學倫理委員會通過，篩查人群（或監護人）都簽署知情同意書。

1.2 研究方法

①液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）進行血液氨基酸和酰基肉堿檢測。

②氣相色譜-質譜（GC-MS）進行尿液有機酸檢測。

③基因診斷。基因組DNA的提取；PCR擴增，PAH基因的引物序列參照文獻設計[3]，反應總體積為25 μL，循環條件為97℃ 5 min預變性，共35個循環（包括 94℃45s，55℃45s，72℃45s），72 ℃延伸 10 min，4℃保存。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行測序。

2 結果

2.1 代謝篩查結果分析

8例患兒遺傳代謝篩查結果見表1，其中2例在血液氨基酸、酰基肉堿檢測和尿液有機酸檢測中都檢出了相關物質，分別是患兒4：Phe為364.996 μM，尿液中檢出苯乙酸 （Phenylacetic acid）； 患兒5：Phe為954.070 μM，尿液中檢測出苯乳酸（Phenyl lactate）和苯乙酸；6例在血液氨基酸和肉堿檢測中Phe不同程度的上升，而尿液有機酸檢測未見相關物質，3例未知。

表1 遺傳代謝篩查結果

2.2 基因檢測結果分析

8例患兒基因檢測結果見表2，PAH共檢測出7種突變類型，分別是內含子4上的剪接突變c.442-1G＞A， 外顯子 7 上的錯義突變 c.721C＞T、c.728G＞A和終止突變c.781C＞T，外顯子12上的錯義突變c.1238G＞C、c.1256A＞G、c.1301G＞A。所有基因檢測都對其父母進行了檢測，證實了共分離。

表2 代謝篩查和基因診斷結果

3 討論

苯丙酮尿癥其發病機制見圖1，當苯丙氨酸不能轉化為酪氨酸在體內異常蓄積，產生對人體有損害的苯丙酮酸和一系列旁路代謝產物，如苯乙酸、苯乳酸（患兒特征性的鼠尿味就是旁路代謝產物中的苯乳酸），會引起一系列神經系統損害。由于苯丙氨酸羥化酶只在肝臟細胞中表達，而在羊水和絨毛細胞中不表達，所以新生兒遺傳代謝病篩查和基因診斷是實現疾病早期診斷的的有效手段[4]。通過研究PAH基因的突變譜，可以有效探究PAH基因型和臨床表型的相關聯性，也為研究苯丙酮尿癥的遺傳咨詢和產前診斷打下了基礎。

圖1 苯丙氨酸羥化酶的代謝圖

1983年科學家首次分離出了人類PAH基因，這為苯丙酮尿癥的基因診斷奠定了基礎。PAH基因位于12號染色體的長臂q22-q24.1，全長約100 kb，編碼區包含13個外顯子。迄今為止科學家已經發現一千余種突變，85%位于編碼區的外顯子上，15%位于內含子區、3’和5’區；根據對PAH酶活性有無影響，基因突變分為沉默突變和致病性突變。沉默突變顧名思義是對PAH酶活性無影響，而致病性突變多位于外顯子、外顯子和內含子的交接部分，突變直接影響PAH基因的轉錄、mRNA的翻譯以及蛋白質的折疊與聚合的異常，進而影響酶的催化活性。

該研究共檢測出7種突變類型，分別是內含子4上 c.442-1G＞A， 外顯子 7 上的 c.721C＞T、c.728G＞A和 c.781C＞T，外顯子 12上的 c.1238G＞C、c.1256A＞G、c.1301G＞A，突變種類最多的集中在第7和12外顯子，這與世界范圍內突變最多的是PAH基因第7外顯子，集中了大約16%的突變是一致的；因為第7外顯子是編碼PAH蛋白核心功能區，對保持該酶活性起關鍵性作用。

該研究突變次數最多的是c.728G＞A共突變4次，該突變位點在中國人群中是高頻突變位點，占總突變的18%[5]，東北人中的頻率18%，山西接近19%，南方人群略低9.5%，該位點已被證實為致病性突變[6]。東歐最常見的為第12外顯子的c.1223G＞A（R408W），俄羅斯遠東地區占63%；第5外顯子的c.473G＞A（R158Q）基因突變在歐洲及拉美等國極為普遍，如荷蘭的發生率為13.0%、比利時為9.0%、波蘭、匈牙利、德國和捷克等國發生率都在5.0%以上[7]，但該突變在中國突變頻率卻較低，只有0.8%。美國最常見的突變位點是 c.1241A＞G（Y414C），約占 18.7%，這些說明PAH基因突變呈現高度種族和地區差異，熱點突變在不同種族、不同地區均有不同。

亞洲PAH基因突變與歐美國家存在很大差異，日本苯丙酮尿癥的發病率為1/78 400，最高頻的突變是 c.1238G＞C（R413P），占 30.5%；韓國苯丙酮尿癥的發病率為 1/41 000，最高頻的突變是 c.728G＞A（R243Q），占12%[8]；臺灣地區苯丙酮尿癥的發病率為1/55077，最高頻的突變是 c.721C＞T（R241C），占 32%[8]。

苯丙酮尿癥患兒由于在新生兒期缺乏明顯的特異癥，這就給臨床醫生的早期診治帶來了困難，1953年德國Bickel醫生首先應用了低Phe飲食治療法獲得成功，迄今該療法仍然是治療PKU最有效的方法。低Phe飲食療法的治療原則是既要使Phe的攝入量保證患兒生長發育和體內代謝的最低需要，又不使血中Phe過高。治療過程中應給予特殊的低Phe奶粉，再配合其他低蛋白質食物和少量乳類，以達到最佳效果。值得注意的一點是，由于母乳中Phe的含量遠遠比其他食物要低，所以適當的搭配母乳喂養，也是有助于苯丙酮尿癥患兒生長和發育的。近年也有研究學者不斷提出新的治療策略：如PKU特殊奶粉中加入L-肉堿；大分子中性氨基酸 （large neutral amino acids，LNAAs）的補充降低血 Phe濃度等[9-10]。 治療過程中定期的監控是不可避免的，血液中Phe濃度檢測是患兒近期飲食治療控制情況的重要客觀指標，不斷的根據患兒的臨床表現和各項檢測指標，隨時修改患兒的治療方案，同時嚴密監測患兒體格、生長發育以及智力能力水平，進行有效的干預指導。