肺癌患者外周血中循環腫瘤細胞(CTC)與D-二聚體、纖維蛋白原及血小板水平的關系研究

潘榮濤

山東省泰山醫院腫瘤內科，山東泰安 271000

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因。據世界衛生組織統計，每年有超過 170萬人因肺癌死亡。在中國，肺癌是發病率最高的癌癥，2015年新發病例達73萬例。據報道，中國68%的肺癌患者在診斷時已屬晚期。病發后患者如未能得到及時有效治療，便會對其生命安全造成威脅。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的類型，約占所有肺癌患者的 85%，其中25%～30%為鱗狀細胞癌，50%～65%為非鱗非小細胞肺癌。患者的生存率與診斷時的腫瘤分期和類型高度相關[1]。而凝血系統相關因子，如D-二聚體（D-D）、纖維蛋白原（FIB）及血小板水平（PLT）則能夠對腫瘤細胞的發生、發展及轉移產生影響[2-3]。因此，臨床有必要圍繞肺癌患者外周血中CTC與D-D、FIB及PLT的關系開展研究，明確其相互之間的聯系。該院就2013年1月—2018年1月收治的100例肺癌患者病例資料開展研究，均檢測D-D、FIB及PLT等指標，旨在為明確肺癌患者外周血中CTC與D-D、FIB及PLT的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機抽取該院收治的100例肺癌患者病例資料進行整理分析，納入標準[4]：①患者均經過醫院病理學檢查確診；②研究方案確定并經過醫院倫理委員會批準后實施；③患者及其家屬均簽署知情同意書。排除標準：①合并嚴重心腎肺等器官疾病者，如器官衰竭等；②合并神經系統疾病，精神狀態異常者；③合并血栓性疾病及凝血功能疾病；④研究前使用激素或短期內應用抗凝、止血藥物者；⑤參與其他研究者。100例患者中，男性58例，女42例，年齡 40～75歲，平均（57.4±1.4）歲；癌癥類型：鱗癌 45 例、腺癌 32 例、小細胞肺癌23例；采用國際肺癌相關標準進行TNM分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期16例、Ⅲ期35例、Ⅳ期35例。

1.2 方法

D-D、FIB檢測儀器均為法國STAGO全自動血凝儀急性檢測，試劑則采用配套試劑；PLT水平檢測使用邁瑞BC6008全自動血細胞分析儀及其配套試劑進行檢測；采集患者清晨空腹靜脈血，觀察并檢測外周血中D-D、FIB及PLT水平，并采用免疫磁珠陰性分離及免疫細胞化學染色方法檢測CTC的表達，進一步分析CTC與D-D、FIB及PLT水平與肺癌患者臨床病理特征的關系。具體操作如下：將血液與淋巴細胞分離液體恢復溫度18℃～25℃，取7.5 mL抗凝血與7.5 mL磷酸鹽緩沖液，在50 mL的離心管中充分混勻后，緩慢貼壁加入另一個裝有15 mL淋巴細胞分離液的分離管中，于正常室溫下400×g離心30 min。吸取環狀乳白色單個核細胞層，加入5倍體積的PBS混勻，于室溫下300×g離心15 min，抽取上清，沖洗2遍后將細胞沉淀，重懸與80 μL磁珠緩沖液中，加入由德國Miltenyi Biotec公司成長的CD45抗體20 μL，輕輕混勻后置入4℃冰箱中孵育15 min，后加入20倍體積的磁珠緩沖液，室溫下300×g離心15 min，棄上清，加入500 μL緩沖液重懸細胞，重復2遍，收集從分流柱下流出的液體，后離心10 min，將沉淀部分均勻涂抹于防脫載玻片，室溫下風干；4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS液洗滌5 min，加入由美國Cell Signaling公司生產的鼠抗廣譜細胞角蛋白，保存于4℃冰箱中，孵育20 min，PBS浸洗，二氨基聯苯胺顯色，后進行仔細觀察。

1.3 結果判定

D-D正常范圍為0～0.55 mg/L、FIB正常范圍為1.8～3.5 g/L、PLT 水平正常范圍為 （125～350）×109/L。CTC陽性標準：細胞呈圓形、橢圓或長形，長徑＞10 um，光鏡下可見完整細胞心態及細胞核；有完整的細胞膜，Pan-CK染色陽性，細胞質呈黑色或褐色。有1～2名實驗人員在光鏡下仔細觀察細胞顯色情況[5]。

1.4 統計方法

該次研究在處理數據時采取SPSS 20.0統計學軟件。計量數據以均數t標準差（x±s）表示，采取獨立配對t檢驗；計數數據以百分比（%）表示，采取χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D-D、FIB與PLT水平表達情況

100例肺癌患者D-D、FIB及PLT水平平均分別為（1.74±2.06）mg/L、（3.53±1.42）g/L、（311.25±135.69）×109/L，D-D、FIB 水平、PLT水平均與肺癌患者遠處轉移情況有關差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表 1 D-D、FIB 與PLT水平表達情況（x±s）

2.2 外周血中CTC與D-D、FIB及PLT水平之間的關系

100例肺癌患者中，CTC陽性55例、CTC陰性45例，CTC陽性患者 D-D、FIB及 PLT水平分別為（2.32±2.42）mg/L、（3.75±1.45）g/L、（337.69±130.15）×109/L，CTC陰性患者D-D、FIB及PLT水平則分別為（0.94±1.03）mg/L、（3.12±1.24）g/L、（229.35±128.66）×109/L， 差異有統計學意義 （t=3.568、2.305、4.163，P=0.000、0.012、0.000）。

2.3 肺癌患者的遠處轉移情況與CTC表達的關系

有遠處轉移患者CTC陽性率92.86%（29/35），無遠處轉移患者CTC陽性率53.85%（35/65），差異有統計學意義（χ2=7.099，P=0.008）。

3 討論

肺癌是臨床常見疾病，由吸煙、職業環境接觸、電離輻射、肺部慢性感染等內外在因素導致，具有發病率高、死亡率高等特點[6]。病發后，患者可出現咳嗽、痰中帶血、咯血、胸痛、胸悶、氣急等臨床表現，部分患者可伴隨肺炎、肺不張、惡性胸腔積液等疾病，嚴重影響機體生活質量及生命健康[7]。據臨床資料[8-9]記載，肺癌患者中有近90%死亡是由腫瘤轉移導致，故而部分學者認為有效控制腫瘤轉移可穩定患者病情，為后續治療建立良好基礎。而CTC則是癌癥細胞形成遠處轉移病灶的關鍵，故而有必要對其開展相關研究，進一步明確CTC與癌癥患者之間的關系，判斷是否能夠將其作為檢測腫瘤治療方案制定及評估療效的重要指標。

該研究中，存在遠處轉移患者中，CTC陽性率為92.86%，明顯高于無轉移患者的53.85%，對比差異有統計學意義（P＜0.05）。 而患者D-D、FIB及PLT水平等指標在有無遠處轉移的條件下均差異明顯，可通過觀察D-D、FIB及PLT水平等指標來對患者病情及轉移情況進行評判。在臨床中D-D指標作為交聯纖維蛋白經纖溶酶分解后的最終末產物，是機體內部高凝狀態及纖溶系統亢進的重要分子標志物，一旦出現升高則表明繼發性纖溶亢進。FIB則為一種在肝內合成的急性期反應蛋白，是血漿含量最高的凝血因子，也是臨床中各內科疾病的重要檢測指標。據了解[10]，腫瘤細胞可分泌PLT凝集活性因子，并促進PLT在腫瘤細胞表面黏附、聚集，同時釋放出PLT源性生長因子，能夠促使腫瘤在轉移部位生長。該研究結果提示，CTC陽性患者D-D、FIB及PLT水平分別為 （2.32±2.42）mg/L、（3.75±1.45）g/L、（337.69±130.15）×109/L，CTC陰性患者D-D、FIB及PLT水平則分別為（0.94±1.03）mg/L、（3.12±1.24）g/L、（229.35±128.66）×109/L，證實D-D、FIB及PLT水平等指標均可參與并促進CTC的轉移和生長；且通過觀察臨床其他學者圍繞肺癌患者外周血中循環腫瘤細胞(CTC)與D-二聚體、纖維蛋白原及血小板水平的關系開展研究結果來看，其結果與該研究結果相同，均認為D-D、FIB及PLT水平等治療參與并促進CTC的轉移和生長。但是由于目前臨床針對上述理論開展研究相對較少，其相互之間的作用及影響仍舊有待進一步研究查證。

綜上所述，針對肺癌患者實施預防性抗凝治療能夠提高治療效果，通過改善D-D、FIB及PLT水平等指標，可減少腫瘤的復發、轉移，來實現減緩腫瘤進展的目的，使患者生存時間得以延長。