HPLC 測定（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽中有關(guān)物質(zhì)

梅 妙，陳明煌（.杭州珠聯(lián)醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 3005；.杭州民生濱江制藥有限公司，浙江 杭州 3005）

阿巴卡韋是葛蘭素史克公司推出的非常重要的抗HIV藥物，它不但是核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中非常重要的一種藥物，而且也是進(jìn)行雞尾酒療法不可或缺的一種重要組成成分，具有非常廣闊的市場空間。

（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽是合成阿巴卡韋的關(guān)鍵中間體，本研究根據(jù)阿巴卡韋合成工藝路線，確定（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽原料可能存在的有關(guān)物質(zhì)（1R，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽（雜質(zhì) A），（1R，4S）-2-乙酰基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮（雜質(zhì) B）和 N-（（1R，4S）-4-（羥甲基）環(huán)戊-2-烯基）乙酰胺（雜質(zhì)C），結(jié)構(gòu)式見圖1。為更好地控制（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽的有關(guān)物質(zhì)，本實驗采用異硫氰酸苯酯將樣品及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行柱前衍生 （（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽和雜質(zhì)A與異硫氰酸苯酯分別反應(yīng)生成相應(yīng)衍生物，雜質(zhì)B與甲醇反應(yīng)，具體衍生結(jié)果見圖2），再使用HPLC梯度洗脫，重點對（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽的有關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀；XS105DU型梅特勒電子天平。

圖1 （1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽及雜質(zhì)A～C的結(jié)構(gòu)式

圖2 衍生后結(jié)構(gòu)式及雜質(zhì)B反應(yīng)后結(jié)構(gòu)式

（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽（對照品，批號：130801，純度：99.35%）、（1R，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽（雜質(zhì)A對照品，批號：140115，純度：97.96%）、（1R，4S）-2-乙酰基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮（雜質(zhì)B對照品， 批號：131108，純度：97.39%）、N-（（1R，4S）-4-（羥甲基）環(huán)戊-2-烯基）乙酰胺（雜質(zhì) C 對照品，批號：131203，純度：95.86%）均由浙江九洲藥物有限公司提供，（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽 （供試品，批號：131201，131202，131203）由上海貝美醫(yī)藥科技有限公司提供；乙腈，甲醇，三乙胺和異硫氰酸苯酯均為色譜級，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 各儲備溶液的配制

2.1.1.1 衍生化試劑

衍生化試劑（1）：1 mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺溶液3.5 mL，加入25.0 mL容量瓶，用乙腈稀釋。

衍生化試劑 （2）：0.05 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液 ：取異硫氰酸苯酯（PITC）150μL到25.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋（此溶液須臨用現(xiàn)配）。

稀釋劑：甲醇。

2.1.1.2 對照儲備溶液

（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽對照品儲備液：精密稱取 30 mg （1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽（130801）對照品，置于10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，即得（3000 μg/mL）。

按相同操作可得雜質(zhì)A儲備液 （雜質(zhì)A（140115） 對照品精密稱取 45 mg，4500 μg/mL）、雜質(zhì)B儲備液（雜質(zhì)B（131108）對照品精密稱取90 mg，9000μg/mL）、 雜質(zhì) C儲備液 （雜質(zhì) C（131203）對照品精密稱取 90 mg，9000 μg/mL）。

2.1.1.3 衍生溶液儲備液

（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽衍生溶液儲備液：精密量取 1.0 mL（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽對照品儲備液置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化試劑（1），振蕩混勻；再加入 1 mL 衍生化試劑（2），室溫靜置反應(yīng)2 h后，用稀釋劑定容至刻度，即得，記為A溶液（300μg/mL）。

同理取雜質(zhì)A儲備液，雜質(zhì)B儲備液，雜質(zhì)C儲備液各1.0 mL分別置于三個容量瓶中進(jìn)行衍生，得雜質(zhì)A衍生溶液儲備液，記為B溶液（450μg/mL），雜質(zhì)B衍生溶液儲備液，記為C溶液（900μg/mL）和雜質(zhì)C衍生溶液儲備液，記為D溶液（900 μg/mL）。

雜質(zhì)衍生溶液儲備液：分別從A、B、C、D溶液精密量取1.0 mL置于同一100.0 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并定容至刻度，即得，記為E溶液。

2.1.1.4 QL衍生溶液儲備液：

（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽QL衍生溶液儲備液：將A溶液先用稀釋劑稀釋100倍，再精密量取此溶液1.7 mL至10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽QL衍生溶液儲備液，記為F溶液。

按相同操作得雜質(zhì)A QL衍生溶液儲備液，記為G溶液（B溶液稀釋100倍后，取1.0 mL）；雜質(zhì)B QL衍生溶液儲備液，記為H溶液（C溶液稀釋100倍后，取1.7 mL）；雜質(zhì)C QL衍生溶液儲備液，記為Ⅰ溶液 （D溶液稀釋100倍后，取2.0 mL）。

2.1.2 系統(tǒng)適用性溶液的配制

精密量取E溶液1.0 mL置于10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得；（其中（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽濃度為 0.3μg/mL，雜質(zhì) A濃度為0.45μg/mL，雜質(zhì)B和雜質(zhì)C濃度均為0.9μg/mL，分別相當(dāng)于供試衍生溶液的0.1%，0.15%，0.3%）。

2.1.3 線性溶液

精密量取 E 溶液 0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、3.0 mL 分別置于不同 10.0 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得50%、80%、100%、120%、150%、300%線性溶液。

2.1.4 QL衍生溶液的配制

分別精密量取F，G，H，Ⅰ溶液各1.0 mL置于同一10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.5 空白衍生溶液的配制

精密量取1 mL稀釋劑置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化試劑（1），振蕩混勻；再加入1 mL衍生化試劑（2），室溫靜置反應(yīng)2 h后，用稀釋劑定容至刻度即得供試品空白衍生溶液；此溶液稀釋1000倍即得系統(tǒng)適用性空白衍生溶液。

2.1.6 供試衍生溶液的配制

精密稱取 30 mg ABA20（131201）供試品，置于10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并定容至刻度，此為供試品儲備溶液；精密量取1 mL上述溶液置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化試劑（1），振蕩混勻；再加入 1 mL 衍生化試劑（2），室溫靜置反應(yīng)2 h后，用稀釋劑定容至刻度，即得供試品衍生溶液；（300μg/mL）

2.1.7 加標(biāo)供試衍生溶液的配制

精密量取供試品儲備溶液1 mL，置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化試劑（1），振蕩混勻；再加入1 mL衍生化試劑（2），室溫靜置反應(yīng)2 h后，再精密量取E溶液1.0 mL于同一10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.8 回收率溶液

精密量取供試品儲備溶液1 mL，置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化試劑（1），振蕩混勻；再加入1 mL衍生化試劑（2），室溫靜置反應(yīng)2 h后，再精密量取 F，G，H，Ⅰ溶液各 1.0 mL于同一10.0 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得樣品+QL溶液；同理可得樣品+100%溶液（精密量取E溶液1.0 mL）和樣品+150%溶液（精密量取E溶液1.5 mL）。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm ×5.0 μm）； 流 動 相 A 為 10 mmol/L KH2PO4（稱取2.72 g KH2PO4置于2 L燒杯中，加純化水溶解并慢慢搖勻，直至2.0 L，過濾，超聲即可），流動相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：B變化：0～5 min，8%；5～8 min，8%→25%；8～22 min，25%→27%；22～27 min，27%→70%；27～35 min，70%；35～35.1 min，70%→8%；35.1～45 min，8%；柱溫為25℃，樣品室溫度為5℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為UV 204 nm，進(jìn)樣量為10μL，洗針溶劑為甲醇。

取系統(tǒng)適用性溶液和系統(tǒng)適用性空白衍生溶液（配制見“2.1.2”和“2.1.5”）進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，結(jié)果表明，雜質(zhì)A，雜質(zhì)B，雜質(zhì)C各雜質(zhì)與主成分（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽有較好的分離度。結(jié)果見圖3。

圖3 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.3 專屬性實驗

通過比較空白溶液（有供試品空白衍生溶液和系統(tǒng)適用性空白衍生溶液，配制見“2.1.5”）、雜質(zhì)對照衍生溶液 （即系統(tǒng)適用性溶液，配制見“2.1.2”）、供試衍生溶液（配制見“2.1.6”）和加標(biāo)供試衍生溶液（配制見“2.1.8”），確定在系統(tǒng)適用性實驗中，該色譜條件專屬性強(qiáng)，各雜質(zhì)與主成分分離度良好，在供試品實驗中，供試衍生空白溶液中RT≈11.2 min左右的峰對雜質(zhì)B其中一個峰（雜質(zhì)B’）有干擾，須扣除相應(yīng)濃度的空白峰峰面積，其他雜質(zhì)無干擾，且經(jīng)DAD檢測器檢測，主峰純度良好（主峰純度均大于峰純度閾值990.0），故整體而言，該方法專屬性較強(qiáng)。結(jié)果見圖4。

2.4 線性實驗

按確認(rèn)的驗證范圍，以100%雜質(zhì)對照衍生溶液濃度為基礎(chǔ)，用稀釋劑為溶劑，分別配制QL、50%、80%、100%、120%、150%、300%線性濃度系列（溶液配制見“2.1.3”和“2.1.4”），作為線性測定溶液。每個溶液配制1份，QL進(jìn)樣6針，其他每份進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。以峰面積對濃度得到線性方程和相關(guān)系數(shù)r2。要求測得各溶液的相關(guān)系數(shù)r2不得小于0.99。測得結(jié)果詳見表1。

表1 線性實驗結(jié)果

由以上數(shù)據(jù)可知，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C及未知雜質(zhì)的線性滿足要求。

2.5 穩(wěn)定性實驗

按“2.1”項下配制的雜質(zhì)對照衍生溶液（即系統(tǒng)適用性溶液，見“2.1.2”），（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽供試衍生溶液 （見“2.1.6”）、及加標(biāo)供試衍生溶液（見“2.1.8”）各 1 份，冷藏條件下，分別于0 h、14 h、25 h取樣測定，以0 h測得各組分峰面積為基準(zhǔn)，計算在不同測定時間測得各組分峰面積的回收率，測得結(jié)果詳見表2。

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

圖4 專屬性實驗色譜圖

由以上數(shù)據(jù)得，供試衍生溶液、雜質(zhì)對照衍生溶液及加標(biāo)供試衍生溶液在冷藏條件下存放25 h 后， 各雜質(zhì)及 （1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽峰面積的回收率均在90%～110%范圍內(nèi)（計算上雜質(zhì)B已扣除空白的干擾），同時比較在不同時間測得色譜圖，沒有降解峰出現(xiàn)，也沒有峰消失。說明供試衍生溶液、雜質(zhì)對照衍生溶液及加標(biāo)供試衍生溶液在冷藏條件下可以穩(wěn)定存放25 h。

2.6 定量限及檢測限

各物質(zhì)的定量限即為其線性范圍的最低點。取（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽和各雜質(zhì)衍生儲備液適量逐級稀釋，配成一系列濃度的混合溶液，分別進(jìn)樣，當(dāng) S/N≈10時，（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽、雜質(zhì)B的濃度相當(dāng)于雜質(zhì)對照衍生溶液的17%，雜質(zhì)A的濃度相當(dāng)于雜質(zhì)對照衍生溶液的10%，雜質(zhì)C的濃度相當(dāng)于雜質(zhì)對照衍生溶液的20%（樣品配制見“2.1.1”和“2.1.4”）。 平行進(jìn)樣定量限溶液 6 針，計算（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C峰面積的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，要求RSD不得大于10%。檢測限=1/3定量限，由定量限計算得到，測得結(jié)果詳見表3。

表3 定量限及檢測限實驗結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度實驗

準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。本實驗設(shè)計了QL、100%和150%三個不同濃度測試點，配制過程見“2.1.8”回收率溶液的配制，每個濃度點制備1份。以供試衍生溶液 （配制過程見“2.1.6”）為基礎(chǔ)，計算各雜質(zhì)在各測試點的回收率平均值，測得結(jié)果詳見表4。

表4 準(zhǔn)確度實驗結(jié)果

從表4可以得知，在QL～150%的設(shè)定范圍內(nèi)，結(jié)果符合50%～150%要求，說明該分析方法有較好的準(zhǔn)確度。

2.8 精密度實驗

分別配制6份100%加標(biāo)供試衍生溶液和1份供試衍生溶液（配制過程見“2.1.6”和“2.1.8”），以供試衍生溶液為基礎(chǔ)計算6份100%加標(biāo)供試衍生溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C峰面積的回收率，并用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD評價測得回收率，測得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C回收率的RSD分別為0.74%、5.75%、3.26%，均滿足RSD不得大于10%的要求，重復(fù)性良好。

2.9 樣品測定

分別稱取 3 批 （1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽樣品適量，按“2.1.6”進(jìn)行樣品衍生配制，作為供試品溶液；，再按“2.1.2”配制對照溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算各有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

3.1 稀釋劑的選擇

根據(jù)（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽和各雜質(zhì)的溶解性，同時結(jié)合衍生條件所使用的溶劑，首先嘗試了乙腈，但溶解性沒有甲醇好，儲備液無法完全溶解，故放棄，DMF和DMSO在衍生后測定會有較大干擾，結(jié)合種種，最終選擇甲醇。

3.2 衍生溶劑量的確定

查閱相關(guān)衍生文獻(xiàn)，再結(jié)合衍生最好在3 h內(nèi)完成的考慮，嘗試了（1）0.03 mol/L PITC乙腈溶液，常溫和 50℃各衍生 1 h，2 h，3 h；（2）0.04 mol/L PITC乙腈溶液，常溫和25℃各衍生1 h，2 h，3 h；（3）0.05 mol/L PITC乙腈溶液，常溫和25℃衍生1 h，2 h，3 h 等條件的刪選，后發(fā)現(xiàn)：（1）不管 25 ℃還是50℃，雖加速了衍生，但也破壞了其中有些雜質(zhì)，使總雜偏大，故選擇常溫衍生；（2）常溫衍生下，0.03 mol/L和0.04 mol/L的PITC乙腈溶液3 h內(nèi)均不能使樣品完全衍生，使用0.05 mol/L的PITC乙腈溶液，在1 h時，樣品未衍生完全，對比2 h和3 h，峰面積基本穩(wěn)定，故推斷樣品2 h可完全衍生，綜合所有，最終選擇0.05 mol/L的PITC乙腈溶液常溫衍生2 h。

3.3 注意事項

在實驗中，由供試品空白衍生溶液譜圖中得，隨著時間的延長，原有RT≈11.2 min小峰的峰面積在增大，對雜質(zhì)B’的干擾會變大，且雜質(zhì)B和雜質(zhì)C易受堿性條件的影響，為保證實驗的準(zhǔn)確性，故0.05 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液須臨用現(xiàn)配，且控制樣品池溫度在5℃，樣品檢測及時完成。

3.4 雜質(zhì)的確定

根據(jù)（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽合成阿巴卡韋的工藝路線，確定（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽中主要包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C和未知雜質(zhì)，衍生后還包括衍生雜質(zhì)，通過LC-MS的結(jié)構(gòu)確證及相關(guān)雜質(zhì)的制備，準(zhǔn)確確定了存在的各種雜質(zhì)，該方法準(zhǔn)確、可靠，為阿巴卡韋中間體-（1S，4R）-（4-氨基環(huán)戊-2-烯基）甲醇鹽酸鹽提供了切實可行的質(zhì)控方法。