不同模式的低氧訓練對骨骼肌肌球蛋白合成及其mTOR信號通路的影響

楊加玲 王海軍

江蘇省連云港師范高等?？茖W校（連云港 222006）

高住高練（living high-training high，HiHi）和高住低練（living high-training low，HiLo）是低氧訓練的兩種常見模式[1]，HiHi是在低氧環境中生活和訓練，而Hi-Lo是在低氧條件下生活，但在常氧環境下進行運動訓練。研究表明，在高原低氧和運動缺氧的雙重刺激下，機體蛋白質的降解率會大于其合成率，導致機體蛋白質丟失，引起肌肉萎縮，肌力下降[2，3]，從而影響了高原訓練的效果。與高原訓練相比，HiLo可使骨骼肌蛋白質丟失的程度減少，在一定程度上可維持骨骼肌的收縮力量[1]。但是，在模擬高原訓練或HiLo過程中，骨骼肌蛋白質含量降低的機制目前還不完全清楚。有研究表明，在骨骼肌蛋白質合成的調節過程中，PI3K/Akt/mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信號通路具有非常重要的促進作用[4，5]，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性可明顯促進骨骼肌的廢用性萎縮，而PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可使骨骼肌廢用性萎縮的程度明顯下降[4]。但是，PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路在調節低氧運動訓練過程中骨骼肌合成中的作用目前研究很少。本研究對大鼠進行低氧暴露和/或大強度的運動訓練，6周后測定大鼠腓腸肌中總蛋白（Pro）和肌球蛋白（Myo）含量，同時測定腓腸肌中PI3K、Akt含量以及mTOR、真核細胞延伸因子2（eukaryotic elongation factor 2，eEF2）和真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，eIF4E-binding proteins，4EBP-1）的mRNA表達，探討不同模式低氧訓練過程中骨骼肌蛋白質合成代謝的變化及其調節機制，旨在促進低氧訓練科學化。

1 對象與方法

1.1 實驗對象和分組

體重130～160 g的雄性SD大鼠50只，由江蘇大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（蘇）2013-0011。在室溫20～22℃的環境下分籠飼養，每籠5只，喂飼國家標準嚙齒類動物固體飼料，自由飲水。大鼠在3天的適應性飼養后，隨機被分成常氧對照組（NC組，n=10）、低氧暴露組（HC組，n=10）、常氧訓練組（NE組，n=10）、模擬高原訓練組（HE組，n=10）和高住低練組（HiLo組，n=10）5組。

1.2 低氧與訓練方案

NC和HC組分別在常氧和低氧環境中生活，不進行運動訓練；NE和HE組分別在常氧和低氧環境中生活和訓練；HiLo組在低氧環境中生活12 h，其余時間在常氧下生活和運動訓練。實驗所需要的低氧環境由The MAG-10 Mountain Air Generator模擬，在第1周內將低氧艙中氧濃度從模擬海拔高度1600 m逐漸增加到3500 m，最終氧濃度為13.6%。NE、HE和HiLo組在下午進行負重游泳訓練，每周6天，訓練6周。在第1周內將常氧下和低氧下訓練大鼠的負重逐漸增加到體重的1.9%（相當于大鼠90%乳酸閾強度）[6]和1.7%[7]，游泳時間漸增到90 min，以后按照此運動強度和時間進行訓練。游泳池為內壁光滑的長方體塑料水桶（120 cm×80 cm×70 cm），游泳池水的深度保持身高的2倍以上，溫度維持在30～33℃之間。

1.3 取材

末次運動訓練后第2天上午進行實驗取材，取材前禁食禁水12 h，腹腔注射20%的烏拉坦溶液對大鼠進行麻醉后，快速分離腓腸肌，將筋膜和脂肪去除，裝于凍存管放入液氮中速凍，最后保存至-80℃冰箱。

1.4 指標測試

腓腸肌Myo、PI3K、Akt含量采用ELISA測定，總蛋白含量采用BCA法測定，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供，儀器為multiskan全波段酶標儀。4EBP-1、eEF2和mTOR mRNA采用Real-time PCR法[7]，RNAiso Plus和cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Green Master（ROX）試劑盒購自Roche Diagnostics，測定儀器為ABI 7500 RT-PCR儀。由上海生物工程有限公司合成引物，序列見表1。

表1 各種指標和GAPDH的引物序列

1.5 數據分析

使用SPSS 22.0統計軟件進行處理，實驗結果用x±s表示，NC、HC、NE和HE 4組之間進行雙因素方差分析，HiLo、NC、HE 3組之間進行單因素方差分析和多重比較，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有極顯著性差異，。

2 結果

2.1 各組大鼠腓腸肌總Pro含量、Myo含量的變化

由表2、表3可知，無論是低氧暴露還是大強度的運動訓練，均使腓腸肌Pro含量顯著降低（P＜0.05，P=0.01），Myo含量也顯著下降（P＜0.01，P=0.05），低氧暴露與運動訓練雖然對降低腓腸肌Pro含量無顯著性交互作用，但對降低Myo含量有顯著性的交互作用（P＜0.05）；HiLo組腓腸肌Pro和Myo含量顯著低于NC組，但顯著高于HE組（P＜0.05）。

表2 各組腓腸肌Pro、Myo含量

表3 各組腓腸肌Pro、Myo含量的雙因素方差分析

2.2 各組實驗大鼠腓腸肌4E-BP1 和eEF2 mRNA表達量的變化

由表4、表5可知，對NC、NE、HC和HE組4組之間進行雙因素方差分析，低氧暴露使腓腸肌4E-BP1 mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），eEF2mRNA表達有所降低，但無顯著性差異；而運動訓練使腓腸肌4E-BP1 mRNA表達量顯著升高，eEF2mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；低氧和大強度運動訓練對4EBP-1 mRNA表達的進一步升高無顯著性交互作用，而對降低腓腸肌eEF2 mRNA表達有顯著性交互作用（P＜0.05）；HiLo組腓腸肌4E-BP1mRNA的表達顯著高于NC組，雖低于HE組，但無顯著性差異；eEF2mRNA表達與NC組相比無顯著性升高，但是顯著高于HE組（P＜0.01）。

表4 各組腓腸肌4E-BP1和eEF2的mRNA表達

表5 各組腓腸肌4E-BP1和eEF2 mRNA表達的雙因素方差分析

2.3 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt含量和mTORmRNA表達的變化

由表6、表7可知，對NC、NE、HC和HE組4組之間進行雙因素方差分析發現，低氧暴露使腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），運動訓練使PI3K含量和mTOR mRNA表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），低氧暴露與運動訓練對降低腓腸肌PI3K和Akt含量無顯著性交互作用，但對降低mTOR mRNA表達具有顯著性的交互作用（P＜0.01）；HiLo組腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達與NC組相比無顯著性變化，但PI3K含量和mTOR mRNA表達顯著高于HE組（P＜0.05）。

表6 各組腓腸肌PI3K、Akt的含量和mTOR的mRNA表達

表7 各組腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達的雙因素方差分析

3 討論

在組成骨骼肌的成分中，蛋白質是最重要的，其中主要的結構蛋白和收縮蛋白是肌球蛋白，其含量的降低不僅可降低骨骼肌的收縮速度，還可減小骨骼肌的收縮力量。為了進一步探討高原訓練過程中導致骨骼肌蛋白質下降的主要原因，本研究通過交互設計的實驗方案對大鼠進行低氧暴露和/或運動訓練，6周后檢測了腓腸肌Pro、Myo含量。結果發現，無論是6周的大負荷游泳訓練還是低氧暴露均顯著降低了大鼠腓腸肌Pro和Myo含量，雖然低氧暴露和運動訓練兩個因素對腓腸肌Pro含量的減少無顯著性交互作用，但對降低Myo含量具有顯著性的交互作用。從而說明，機體長期暴露在低氧環境中或進行大負荷運動訓練時，骨骼肌蛋白質的丟失均增加，而在低氧環境中進行大負荷運動訓練時骨骼肌收縮蛋白的丟失更加明顯。然而HiLo組大鼠腓腸肌Pro和Myo含量雖然顯著低于NC組，但均顯著性高于HE組。因此，與傳統的高原訓練相比，HiLo可以降低大鼠骨骼肌蛋白質丟失的程度。

有研究證實，PI3K/Akt/mTOR信號通路是以mTOR為中心的信號轉導途徑，在細胞生長過程中發揮著關鍵作用[8，9]。它通過調節核糖體S6激酶（p70S6K）、翻譯抑制蛋白4E-BP1、翻譯起始因子eIF4E和eIF4G及翻譯延長因子eEF2等下游信號因子調節蛋白質的生物合成。其中，eEF2屬于翻譯延伸過程中的一種重要的細胞因子，它能與核糖體結合，促進mRNA翻譯延長過程。eIF4E與eIF4A和eIF4G結合形成翻譯起始所必須的eIF4F復合物。由于4E-BP1能和eIF4G競爭性地與eIF4E結合，可阻礙eIF4F復合物的形成，故是eIF4E的抑制因子。因此，4E-BP1是eIF4F復合物形成過程中最為關鍵的調節因子，是mTOR直接作用的底物之一[10，11]。PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化，可能會下調4EBP-1和上調eEF2的表達，進而促進蛋白質的合成[12，13]。

有研究表明，低氧可以通過抑制骨骼肌IGF-1的分泌或阻斷IGF-1介導的Akt/mTOR的激活[14-16]，從而抑制mTOR調節下游的4EBP-1和eEF2（真核細胞延伸因子2）來降低蛋白質合成[17]，而eEF2的磷酸化與去磷酸化的平衡最終影響其活性[18]。運動時AMPK激活，從而激活eEF2激酶的活性，引起eEF2磷酸化，使eEF2活性降低，可抑制蛋白質的合成[18，19]；運動后mTOR激活，能使eEF2去磷酸化，使eEF2活性升高，促進蛋白質的合成。目前不少研究證實，力量訓練可以激活骨骼肌Akt/mTOR信號通路促進蛋白質的生物合成，從而引起骨骼肌體積的增大[20-22]。而耐力性運動訓練對骨骼肌Akt/mTOR信號通路的影響目前研究結果并不一致，且可能與運動強度有關。低強度的有氧耐力性運動訓練并不能使骨骼肌中mTOR活性發生變化[23]，而進行不習慣或大強度的耐力性運動可以通過提高AMPK活性抑制骨骼肌中mTOR的活性[20]。但是有研究發現，28天的耐力性運動訓練可激活大鼠骨骼肌Akt/mTOR/p70S6K信號通路，促進骨骼肌蛋白質的生物合成[24，25]。然而，低氧運動對Akt/mTOR及其下游信號通路影響的報道甚少。有研究證實，HiLo對骨骼肌Akt/mTOR信號通路具有一定的抑制作用，在一定程度上可以抑制蛋白的生物合成[24]。但也有研究發現，低氧暴露可通過抑制骨骼肌mTOR/p70S6K信號通路抑制肌肉蛋白質的合成，在低氧中進行適量的耐力運動鍛煉在一定程度上可削弱低氧對mTOR/p70S6K信號通路的抑制作用[25]。有研究發現，2個月的運動訓練雖然能夠增加血氧正常和血氧低下的慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的運動能力，但運動訓練只能增加血氧正常COPD患者骨骼肌中檸檬酸合成酶和乳酸脫氫酶活性、肌纖維橫截面積和毛細血管纖維比值。與此同時，血氧正常COPD患者骨骼肌中Akt（Ser473）、GSK-3β（Ser9）和p70S6k（Thr389）的磷酸化在運動訓練后無顯著性增加，但在血氧低下的COPD患者中顯著降低[16]，從而進一步說明運動訓練在低氧和常氧下對骨骼肌蛋白質生物合成的影響不同。本研究發現，6周的低氧暴露在顯著降低大鼠腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達的同時，顯著升高4E-BP1 mRNA表達量，而eEF2 mRNA表達無顯著性降低；運動訓練能顯著降低PI3K含量以及mTOR和eEF2 mRNA表達，顯著升高4EBP1 mRNA表達量；且低氧暴露與運動訓練對降低mTOR和eEF2 mRNA表達具有顯著性的交互作用；與NC組相比，HiLo組除了腓腸肌4E-BP1 mRNA的表達顯著升高外，PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達均無顯著性變化，但HiLo組PI3K含量、mTOR和eEF2的mRNA表達顯著高于HE組。

長時間的低氧暴露和大強度的運動訓練，由于骨骼肌能量的大量消耗，一方面激活AMPK，另一方面促進皮質酮的分泌[26]，抑制睪酮和IGF-1的分泌[2]，從而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，顯著上調4EBP-1和下調eEF2 mRNA表達。而低氧聯合大強度運動訓練在一定程度上對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制作用比單純的低氧暴露或大強度運動訓練更大。但是由于HiLo中，低氧暴露的時間比模擬高原訓練要短，從而使HiLo對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制作用比模擬高原訓練要小。因此，在低氧訓練中如何采取低氧暴露時間和運動強度的合理組合，在最大程度上減輕低氧暴露引起的蛋白質丟失，對于提高運動員的運動能力有著非常重要的意義。

4 結論

4.1 模擬高原訓練中，低氧和大強度的運動訓練均能通過抑制骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路，降低骨骼肌蛋白質含量。低氧聯合大強度運動訓練對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路以及蛋白質合成的抑制作用在一定程度上比單純的低氧暴露或大強度運動訓練更大。

4.2 高住低練能夠減輕骨骼肌中PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制程度，減輕抑制骨骼肌蛋白質合成的程度，對于防止低氧引起的骨骼肌蛋白質丟失具有重要作用。