mTOR復合物在有氧運動改善小鼠骨骼肌糖代謝過程中的作用

張鑫愉 周曉勐 牛燕媚 傅力

1天津醫(yī)科大學生理學與病理生理學系（天津 300070）

2航空總醫(yī)院康復醫(yī)學科（北京 100012）

3天津醫(yī)科大學康復系（天津 300070）

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是哺乳動物體內(nèi)與能量代謝相關的關鍵信號蛋白。mTOR在細胞內(nèi)以復合物形式存在，分別為雷帕霉素敏感型mTOR復合物1（mTORC1）和非雷帕霉素敏感型mTOR復合物2（mTORC2）。其中mTORC1具有調(diào)節(jié)細胞增長及蛋白合成的功能，而mTORC2則調(diào)控細胞蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB or Akt）活化及細胞骨架重新合成[1]。在細胞能量代謝過程中，一磷酸腺苷激活激酶（adenosine monophosphate-activated kinase，AMPK）可磷酸化mTORC1核心組分Raptor從而抑制其活性[2]。而 mTORC2在調(diào)節(jié)組織糖代謝穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。骨骼肌特異性敲除其核心組分 Rictor可抑制 mTORC2活性并促進糖原合成，導致機體糖耐量穩(wěn)態(tài)失衡，提示，mTORC2在維持機體糖耐量并抑制糖原合成過程中發(fā)揮重要作用[3]。

骨骼肌包括氧化型和酵解型兩大類肌纖維，其中比目魚肌（Soleus）以氧化型肌纖維為主，是進行葡萄糖有氧氧化的主要肌纖維，而腓腸肌（Gastrocnemius）以酵解型肌纖維為主，主要以糖酵解方式參與運動過程中的能量供應，二者共同調(diào)控機體糖攝取過程。在安靜狀態(tài)下，小鼠骨骼肌攝取葡萄糖量占機體總葡萄糖攝取量的75%。 因此，增加骨骼肌糖攝取對改善機體胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及緩解2型糖尿病具有積極作用[4]。胰島素是調(diào)節(jié)機體血糖水平的主要激素，胰島素通過與細胞膜受體結合引起細胞內(nèi)α受體亞基構象改變，從而促進胰島素受體底物（insulin receptor substrates，IRS）賴氨酸位點磷酸化[5]并結合至磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）上，隨后PI3K將3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）募集至細胞膜，促進Akt-Thr308磷酸化[6]并活化mTORC2結構蛋白的應激活化蛋白激酶作用蛋白1（stress-activated protein kinase interacting protein 1，SIN1）從而激活mTORC2，并在mTORC2與Akt-Ser473之間形成正反饋，最終激活胰島素信號通路[7]。另一方面，胰島素可通過抑制結節(jié)硬化蛋白復合物1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）激活Akt從而活化mTORC1，并激活其下游因子核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）誘導核糖體合成[8]。

Akt作為IRS的下游信號分子，在胰島素信號通路中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，IRS與p58結合募集PI3K[9]，從而將Akt從胞漿轉移至胞膜上[10]，促使Akt-Thr308及Ser473磷酸化并結合至PDK1及mTORC2[11]，從而調(diào)節(jié)胰島素信號通路活性。在這一過程中，Akt可磷酸化Akt 160KD亞基（Akt substrate of 160 KD，AS160）促進葡萄糖轉運子 4（glucose transporter 4，GLUT4）轉位至胞膜從而增加細胞糖攝取；同時，胰島素活化Akt引起轉錄活化因子叉頭框蛋白O（fork head box protein O，F(xiàn)OXO）磷酸化，以此促使FOXO與14-3-3蛋白結合，進而促使FOXO從細胞核轉移至細胞質(zhì)從而抑制糖異生相關酶的表達、催化糖原合成及脂質(zhì)生成[12]。

除此之外，Akt還可通過TSC和富含脯氨酸的40kDa Akt亞基（the proline-rich Akt substrate of 40 kDa，PRAS40）激活mTORC1進而影響機體代謝：一方面Akt直接磷酸化TSC2[13]促使TSC2與TSC1形成復合體從而活化mTORC1；另一方面，PRAS40可與mTORC1相互作用，對mTORC1信號傳導進行負向調(diào)節(jié)[14]。在這一過程中，Akt作為細胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化PRAS40并促進其與 14-3-3蛋白結合[15]，引起PARAS40與mTORC1解離，從而活化mTORC1[16]。

目前，由于采用的運動干預方案的不同，有關運動影響骨骼肌細胞mTOR信號通路及其與糖代謝之間的調(diào)控關系尚不完全清楚，為進一步探究長期有氧運動對小鼠骨骼肌糖代謝的影響，本實驗采用C57BL/6小鼠，通過6周高脂飲食喂飼誘導胰島素抵抗模型，后進行8周、強度為75%VO2max的跑臺運動干預，觀察IRS/Akt/mTOR信號通路活性，分析有氧運動對長期高脂飲食小鼠骨骼肌糖代謝的影響，以期為揭示運動改善代謝性疾病的機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

實驗動物購于北京華阜康生物科技股份有限公司，室溫控制在22℃～25℃，濕度控制在30%～40%，光照/黑暗時間為12/12，小鼠自由進食、水。實驗動物喂養(yǎng)在天津醫(yī)科大學實驗動物中心，符合中國科學院指導下的天津醫(yī)科大學實驗動物關懷及使用管理條例。

50只4周齡C57BL/6小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常飲食組（C組，n=10）和高脂飲食組（n=40），并分別喂飼正常飲食和高脂飲食（脂肪含量為45%）。6周后根據(jù)口服糖耐量（OGTT）和空腹胰島素檢測結果將高脂飲食組25只成模小鼠隨機分為高脂飲食安靜組（H組，n=10）及高脂飲食運動組（HE組，n=15）[19]。H組繼續(xù)喂飼高脂飲食，而HE組小鼠在高脂飼養(yǎng)的同時給予8周有氧跑臺運動干預。

1.2 運動方案

HE組小鼠運動干預前先進行為期1周的適應性跑臺訓練，首次訓練時長為20 min、強度為10 m/min，隨后漸增至12 m/min。運動干預時長為8周、速度為12 m/min，相當于小鼠75%VO2max[17]，1小時/天、5天/周。

1.3 動物組織取樣

6周高脂飼料喂養(yǎng)及 8周運動干預結束后進行取材。取材前，各組小鼠禁食 14 h，小鼠經(jīng)利多卡因眼球局部麻醉后內(nèi)眥靜脈取血。血液4℃靜置30 min后3000 g離心15 min，取上層血清保存于-80℃冰箱備用。取血后立即分離小鼠比目魚肌及腓腸肌，經(jīng)液氮速凍后移至-80℃冰箱備用。

1.4 Western Blot 檢測小鼠比目魚肌胰島素信號通路相關蛋白表達

用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚肌與腓腸肌總蛋白，用垂直電泳儀（Bio-Rad）加入等量比目魚肌蛋白質(zhì)樣品并經(jīng)10%SDS-PAGE膠分離后濕轉至PVDF膜（Millipore）上，隨后使用10%脫脂奶粉封閉1小時，抗體稀釋液（5%BSA/TBST，Sigma）按1∶2000比例稀釋一抗pAkt-S473、pAkt-T308、pAMPK-T172、pIRS1-S307、pS6K1-T389、Raptor、Rictor、mTOR（Cell Signaling Technology），β-actin（北京銳抗生物科技有限公司），4℃搖床孵育過夜。次日，使用1×TBST洗滌3次，每次10min，隨后使用同一抗體稀釋液按1∶20000比例稀釋二抗，室溫搖床孵育1小時后，重復上述洗滌過程。隨后以發(fā)光底物ECL反應液顯影，暗室曝光，膠片掃描后采用Quantity One軟件定量分析并統(tǒng)計各條帶相對灰度值。

1.5 免疫共沉淀法檢測骨骼肌組織Raptor-mTOR，Rictor-mTOR 表達

研究表明，Raptor-mTOR結合反映mTORC1表達量，Rictor-mTOR結合反映mTORC2表達量[18]。用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚肌及腓腸肌總蛋白，利用Invitrogen公司Dynabeads R蛋白G免疫沉淀反應試劑盒分別檢測小鼠比目魚肌及腓腸肌Raptor-mTOR及Rictor-mTOR結合。采用清洗緩沖液（Ab Binding&Washing Buffer）以1∶200比例稀釋mTOR抗體，隨后轉移至裝有磁珠的1.5 ml EP管中，室溫孵育15 min（間歇搖動）。用Washing Buffer重懸磁珠并去除廢液，隨后加入蛋白稀釋液稀釋（1×PBS，0.1%Tween-20）的蛋白樣品（80～100 μg），室溫孵育15 min（間歇搖動），Washing Buffer重懸后棄廢液，20 μl Elution Buffer洗脫抗體-蛋白結合物，-20℃貯存以備Western Blot檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

本實驗數(shù)據(jù)均由 SPSS軟件處理。采取單因素方差分析（One-way ANOVA），計算各組標準差和均值，各組之間的顯著性定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 8周有氧運動對高脂飲食小鼠代謝表型的影響

在本實驗室前期建造模型實驗中發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)14周后小鼠體重、血糖及空腹胰島素水平均顯著增加，提示14周高脂飲食可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，而在高脂飲食的同時進行8周有氧運動干預可有效降低胰島素抵抗小鼠的空腹血糖及胰島素水平[19]。

2.2 8周有氧運動對小鼠比目魚肌Akt/mTOR信號通路的影響

檢測小鼠比目魚肌胰島素信號通路相關蛋白磷酸化水平，結果顯示，與 C組相比，H組小鼠比目魚肌pAkt-T308（P＜0.05），pIRS1-S307表達顯著降低（P＜0.001），而pS6K1-T389顯著增高（P＜0.05）；與H組小鼠對比，HE 組 pAkt-S473（P＜0.05），pAkt-T308（P＜0.05），pAMPKα -T172（P＜0.05），pIRS1-S307（P＜0.001）表達顯著增加，而pS6K1-T389表達顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

2.3 長期高脂飲食和8周有氧運動對小鼠骨骼肌mTORC1/C2蛋白表達的影響

14周高脂喂養(yǎng)后，與C組相比，H組小鼠比目魚肌Rictor-mTOR結合量顯著降低，而Raptor-mTOR結合量明顯增加（P＜0.05）（圖2）。與H組相比，HE組Rictor-mTOR結合量顯著增加，Raptor-mTOR結合量顯著降低（P＜0.05），提示長期高脂飲食可顯著增加比目魚肌mTORC1表達、降低mTORC2表達；而8周有氧運動可顯著降低mTORC1表達、增加mTORC2表達（P＜0.05）（圖2）。

圖2 免疫共沉淀實驗研究各組小鼠比目魚肌Rictor-mTOR（B）、Raptor-mTOR（C）在高脂/高脂+運動干預下的結合水平

與C組相比，H組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR結合顯著增加（P＜0.05），而Rictor-mTOR結合雖有增加趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H組對比，HE組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR顯著降低（P＜0.05），Rictor-mTOR雖有降低趨勢，但無顯著性意義（P＞0.05），提示長期高脂飲食可增加腓腸肌mTORC1含量，但對mTORC2含量無顯著影響；8周有氧運動可顯著降低小鼠腓腸肌mTORC1含量、對mTORC2含量無顯著影響（P＞0.05）（圖3）。

3 討論

3.1 mTORC1/C2與高脂飲食誘導小鼠胰島素抵抗之間的關系

mTOR在感受機體能量狀態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，餐后氨基酸及血糖升高可刺激胰島β細胞分泌胰島素，進而磷酸化IRS并使其結合至PI3K，從而活化下游效應器Akt和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等[20]。其中，Akt一方面抑制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）活性從而抑制糖原合成，另一方面可促進骨骼肌細胞GLUT4轉位至胞膜從而增加糖攝取[21]。細胞葡萄糖及支鏈氨基酸長期過量可活化mTORC1，并促進S6K1磷酸化IRS、抑制IRS與胰島素受體結合，此負反饋調(diào)節(jié)機制可降低細胞胰島素敏感性，導致胰島素抵抗[22，23]。在體實驗發(fā)現(xiàn)，S6K1敲除小鼠可抵抗高脂飲食誘導胰島素敏感性降低及肥胖[24]，而脂肪細胞特異性敲除Raptor小鼠表現(xiàn)出胰島素敏感性增加并對抗高脂飲食誘導肥胖的發(fā)生[25]。已有大量研究表明，在胰島素抵抗情況下，細胞IRS1含量顯著降低。當過表達Rheb或敲除TSC1/2時，mTORC1/S6K1可持續(xù)活化并促進IRS1及IRS2蛋白降解，從而導致胰島素受體及 PI3K含量降低，最終引發(fā)胰島素抵抗[26]。

除mTORC1外，mTORC2對IRS1或Akt也發(fā)生作用，但二者在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中的作用并不完全一致。敲低或抑制mTORC2表達可通過泛素連接酶Fbw8促進IRS1蛋白降解，引起細胞漿內(nèi)非活化的IRS1累積，提示mTORC2在調(diào)節(jié)胰島素敏感性過程中發(fā)揮著重要作用[27]。此外，mTORC2還通過調(diào)節(jié)Akt活性參與胰島素信號轉導，具體表現(xiàn)為Rictor敲除小鼠脂肪及肌肉組織mTORC2及Akt活性均受到抑制，胰島素誘導的葡萄糖攝取量也隨之減少[28]。同時，抑制mTORC2還可增加肝臟糖原合成并抑制糖酵解及脂質(zhì)合成。因此，mTORC2含量及活性降低可導致血糖升高及糖耐量受損[29]。

3.2 骨骼肌組織mTORC1/mTORC2 與有氧運動改善胰島素抵抗的關系

mTOR可參與調(diào)節(jié)包括細胞生長分化、蛋白合成及細胞骨架蛋白構建等多種過程。作為胰島素信號通路的重要組分，mTOR活性受骨骼肌重復收縮活動的調(diào)控并在骨骼肌運動適應過程中發(fā)揮重要作用。由于各家研究所采用的運動形式或時長的不同，目前關于運動調(diào)節(jié)mTOR信號的機制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，單次抗阻運動可增加人體肌肉含量并促進mTORC1及S6K1活化，提示單次抗阻運動后mTORC1的活化與肌纖維蛋白質(zhì)合成代謝有關[30]，而運動個體肌肉的增速與mTORC1活性密切相關[31]。研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠訓練14天后肌肉含量增加43%，而給予雷帕霉素的野生型小鼠肌肉含量則無顯著變化。對于含有雷帕霉素抗性的骨骼肌特異性mTOR突變小鼠，無論是否給予雷帕霉素，其肌肉含量均明顯增加[32]，提示mTORC1在調(diào)控骨骼肌合成代謝過程中發(fā)揮重要作用。人體試驗表明，對給予雷帕霉素的受試者進行抗阻訓練后，其混合型肌肉增加并不顯著[33]。同樣，雷帕霉素也可抑制運動小鼠產(chǎn)生骨骼肌肥大[34]。綜上所述，mTORC1的活化促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝。

Kleinert等發(fā)現(xiàn)，mTORC2在運動中參與調(diào)節(jié)骨骼肌糖攝取[35]。研究表明，敲除Rictor對小鼠運動能力并無顯著影響，但會引起運動后小鼠血糖及血乳酸含量升高、糖原合成降低。在安靜狀態(tài)下，敲除Rictor對骨骼肌糖攝取無顯著影響，但敲除Rictor小鼠運動后骨骼肌糖攝取能力較野生型小鼠下降40%[35]。此外，Hodson等通過人體試驗發(fā)現(xiàn)，當進食及抗阻運動后，骨骼肌mTORC1被激活，同時S6K1活性也增加，而mTORC2無顯著變化[36]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)mTORC1及mTORC2在調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝過程中表現(xiàn)出相互拮抗作用，具體表現(xiàn)為高脂飲食可增加骨骼肌mTORC1表達、降低mTORC2表達，8周有氧運動可顯著逆轉長期高脂飲食引發(fā)的上述改變，并且mTORC2的變化只出現(xiàn)在氧化型肌纖維內(nèi)（比目魚肌），在酵解型肌纖維（腓腸肌）mTORC2的變化并不顯著。

4 結論

長期高脂飲食可引發(fā)機體代謝穩(wěn)態(tài)失衡，有氧運動可顯著改善高脂飲食引起的機體代謝紊亂現(xiàn)象。本研究證明，長期高脂飲食可增加骨骼肌纖維mTOR與Raptor結合，降低比目魚肌（氧化型肌纖維）mTOR與Rictor結合及胰島素信號通路相關蛋白活性。8周有氧運動通過增加小鼠比目魚肌纖維胰島素信號蛋白（pAkt-T308，S473）表達、降低mTOR與Raptor結合，從而逆轉高脂飲食導致的機體代謝失衡。