香附四物湯中阿魏酸和芍藥苷的大鼠腸吸收動力學研究

畢肖林， 朱海燕， 劉陶世， 馬世堂

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.安徽科技學院，安徽 鳳陽 233100)

中藥多以口服途徑給藥,中藥復方是中醫臨床用藥的重要形式和手段。通過研究藥物在體內的吸收動力學過程,明確其在體內的作用途徑和機制,有助于闡明中藥的科學內涵,從而指導臨床合理用藥。

單向灌流法,即對某一腸段進行灌流,根據腸段進出口處灌流液中藥物的濃度差來考察藥物在該腸段的吸收情況。大鼠在體腸灌流是目前運用最廣泛的研究腸吸收的方法,因其試驗條件與藥物在口服給藥后接觸到的腸道環境近似[1-2],能較實際地反映藥物的腸道吸收情況。

香附四物湯出自清代梁廉夫《不知醫必要》卷四,由當歸、川芎、白芍、熟地、木香、香附、延胡索等七味藥組成,是治療婦科氣滯血瘀證原發性痛經的代表性方劑[3]。本試驗通過建立大鼠的在體腸吸收模型,對香附四物湯中的活性成分阿魏酸及芍藥苷在體內的吸收規律進行考察,有助于我們了解香附四物湯這類復方制劑在胃腸道內的吸收特性,為中藥劑型的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀(美國Waters有限公司)、蠕動泵(BT00-300M,保定蘭格恒流泵有限公司)、旋轉蒸發器(RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠)、微量高速冷凍離心機(Thermo Micro 21R,美國Thermo科技有限公司)、T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)、十萬分之一天平(New Classic MS,METTLER TOLEDO公司)、超純水機(Direct-Q5 UV系統,美國Millipore有限公司)。

1.2 試驗材料

阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量99.6%,批號:110773-201313)、芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量96.4%,批號:110736-201438);酚紅(天津市化學試劑研究院);當歸、熟地黃、川芎、炒白芍、延胡索、醋香附、木香(安徽省萬生中藥飲片有限公司);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

1.3 試驗動物

雄性SD大鼠,體重(250±30) g,由上海杰思捷實驗動物有限公司提供,合格證號:SCXK(滬)2013-0006。

1.4 試驗方法

1.4.1 香附四物湯水煎液的制備 稱取香附四物湯組方藥材,按照當歸∶熟地∶川芎∶白芍∶延胡索∶香附∶木香=3∶4∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1配比,經粉碎至粒徑可過40目篩,純水煎煮提取2次,第1次加10倍量純水煎煮2 h,第2次加8倍量純水煎煮2 h,合并2次煎出液,濃縮至1 g/mL,作為香附四物湯水煎劑供試樣品[4]。

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱定阿魏酸、芍藥苷對照品10.12、10.50 mg,加甲醇超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中,分別得質量濃度為1.012、1.026 mg/mL的對照品母液;分別吸取各對照品母液,加適量甲醇稀釋至10 mL,得質量濃度為0.101 2、0.525 mg/mL的混合對照品溶液,4 ℃放置備用。

1.4.2.2 Krebs-Ringer腸營養液配制 稱氯化鈉7.8 g,葡萄糖1.4 g,碳酸氫鈉1.37 g,氯化鉀0.35 g,磷酸二氫鈉0.32 g,氯化鎂0.02 g,溶解于適量純水中,并加純水稀釋至1 000 mL,超聲混勻[5]。

1.4.2.3 酚紅液的配制 稱取酚紅20 mg溶于1 000 mL的Krebs-Ringer腸營養液中,混勻即得[6]。

1.4.2.4 腸灌流液的配制 吸取一定的香附四物湯水提液與定量的酚紅液混合,密閉,并攪拌10 min,制得低、中、高3個不同濃度的香附四物湯腸灌流液。

1.4.2.5 空白腸灌流液 取K-R灌流液適量,按“1.4.5”節試驗方法灌流,收集流出液,即得空白腸灌流液[7]。

1.4.3 色譜條件 色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸(25∶75);柱溫:25 ℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:雙波長320、230 nm;進樣量20 μL。

1.4.4 方法學考察

1.4.4.1 標準曲線的繪制 精密吸取混合對照品母液0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,用K-R液稀釋并定容至10 mL容量瓶中,得系列對照品混合溶液,在“1.4.3”節色譜條件下測定。以對照品峰面積平均值A對濃度C(μg/mL)進行線性回歸,繪制標準曲線。

1.4.4.2 精密度試驗 分別配制低、中、高3個質量濃度的阿魏酸及芍藥苷對照品溶液,按“1.4.3”節下色譜條件進樣,1 d內重復進樣5次,連續進樣5 d,并記錄峰面積,計算日內精密度及日間精密度。

1.4.4.3 回收率試驗 取低、中、高3個質量濃度對照品混合溶液,按“1.4.3”節色譜條件測定5 次,將所得的峰面積帶入回歸方程計算質量濃度,以所得質量濃度與實際質量濃度的比值作為方法回收率。

1.4.4.4 專屬性考察 分別對阿魏酸及芍藥苷混合對照品溶液、空白腸灌流液、空白腸灌流液+混合對照品溶液以及在體單向腸灌流樣品按“1.4.3”節下色譜條件進樣,記錄色譜圖。

1.4.4.5 酚紅標準曲線的繪制 用適量K-R緩沖液分別配制含酚紅10、20、30、40、50 μg/mL的標準溶液,分別吸取0.5 mL,加入0.2 mol/L的NaOH溶液4.5 mL,搖勻,在558 nm下測定并記錄其吸光度,繪制酚紅標準曲線。

1.4.5 大鼠在體單向腸灌流試驗 取雄性SD大鼠,試驗前禁食18 h(自由飲水),麻醉采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射,麻醉后將大鼠放在加熱燈下,以保持其正常體溫。試驗時在大鼠腹腔剪開一個大約4 cm左右的口子,將要測量的四個腸段仔細找出來,并分別進行插管,每段兩根,導管插好后用尼龍扎帶扎緊。四個腸段分別為:十二指腸段為從胃幽門下方1 cm處開始量取約10 cm;空腸段為從胃幽門下方15 cm處開始量取約10 cm;回腸段為從盲腸上方20 cm處開始量取約10 cm;結腸段為從距盲腸1 cm處開始向上量取約10 cm。插完管后將大鼠小腸部分小心放回腹腔,盡量避免卷曲和扭結,切口用等滲生理鹽水浸潤的紗布覆蓋,并每隔10min用37 ℃左右的等滲生理鹽水噴灑在腹部,以保持小腸部分濕潤。手術時須小心謹慎,要注意進口管和出口管保持同一高度,以免重力影響下溢流。試驗時取含低、中、高不同濃度藥液的腸灌流液(預熱至37 ℃)300 mL,先以1.0 mL/min 的流速灌流10 min,再將蠕動泵灌流速度調為0.2 mL/min并保持,預平衡30 min后,于30～45、45～60、60～75、75～90 min時間段收集腸灌流液樣品。試驗結束后處死大鼠,剪下被考察的腸段,測量其長度(L)和內徑(r),計算藥物吸收速率常數(Ka)和有效滲透系數(Peff)。

1.4.6 腸灌流液中酚紅的測定 將收集到的腸灌流液樣品離心,各吸取0.5 mL,分別加入0.2 mol/L的NaOH溶液4.5 mL,以0.2 mol/L NaOH溶液作為空白,測定558 nm下的吸光度,根據酚紅標準曲線計算酚紅濃度。

1.4.7 腸灌流液中藥物濃度的測定 將收集到的灌流液樣品離心,取上清液,按“1.4.3”節下色譜條件進行分析,計算相應濃度。

1.4.8 阿魏酸、芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩定性考察 配制含中濃度阿魏酸和芍藥苷的香附四物湯K-R液,采用稀HCl和稀NaOH溶液調節K-R緩沖液pH值分別為5.51、6.30、7.55、8.98,置于密閉容器中,于37 ℃水浴中放置,分別于0、3 h取樣,測定阿魏酸和芍藥苷的含量[8]。

1.4.9 數據分析 在體腸吸收試驗中,腸腔內可能有被腸道吸收或者腸管分泌的水分,結果造成灌流液體積發生改變,本試驗采用酚紅法對灌流液體積進行校正。大鼠在體單向腸灌流試驗中所測得的出口處的阿魏酸及芍藥苷的濃度用公式(1)校正[9]:

(1)

阿魏酸及芍藥苷的有效滲透系數(Peff)用公式(2)計算,吸收速率參數(Ka)用公式(3)計算:

(2)

(3)

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 阿魏酸、芍藥苷標準曲線的建立 阿魏酸的回歸方程:A=184 421.185 4C-81 112,R2=0.999 7(n=6),表明阿魏酸在1.012～20.24 μg/mL之間線性關系良好;芍藥苷的回歸方程:A=55 700C-69 526,R2=0.999 7 (n=6),表明芍藥苷在5.25～105 μg/mL之間線性關系良好。

2.1.2 精密度試驗 阿魏酸的日內精密度分別為1.22%、0.36%、0.45%,日間精密度為1.78%、0.47%、0.27%;芍藥苷的日內精密度分別為1.62%、0.84%、0.42%,日間精密度為1.68%、0.98%、0.66%,表明精密度良好。

2.1.3 回收率試驗 阿魏酸的回收率分別為98.4%、99.2%、99.4%,RSD分別為2.86%、1.23%、1.89%;芍藥苷的回收率分別為98.1%、98.5%、99.1%,RSD分別為2.01%、1.78%、2.93%。

2.1.4 專屬性考察 由圖1可知,在此條件下空白腸灌流液對阿魏酸、芍藥苷的測定無干擾,目標成分的測定也不受樣品中的其他成分的干擾。

A:空白腸灌流液,B:阿魏酸對照品,C:芍藥苷對照品,D:空白腸灌流液+阿魏酸、芍藥苷混合對照品液,E:阿魏酸腸灌流樣品,F:芍藥苷腸灌流樣品

2.2 酚紅標準曲線的建立

酚紅的標準曲線方程:A=0.186 49C+0.015 78,R2=0.999 6 (n=5),表明酚紅質量濃度在10～50 μg/mL之間線性關系較好。

2.3 阿魏酸、芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩定性考察

由表1可知,阿魏酸和芍藥苷在pH值不同的K-R液中的穩定性良好,因考慮到腸道環境,故選取pH值7.5左右的K-R緩沖液進行試驗。

表1 阿魏酸和芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩定性考察

2.4 在體單向腸灌流試驗結果

由表2可知，在所研究的質量濃度范圍之內,隨著阿魏酸和芍藥苷質量濃度的增加,其在大鼠小腸內的吸收情況無明顯變化。低濃度的腸灌流液與高濃度的腸灌流液相比較,阿魏酸和芍藥苷在大鼠各個腸段的Peff均無顯著性差異(P>0.05),這表明阿魏酸和芍藥苷在大鼠小腸內的吸收方式主要是被動轉運,且沒有自身濃度抑制作用。

在同一質量濃度下比較其在十二指腸、空腸、回腸、結腸的Peff、Ka值,發現阿魏酸和芍藥苷在十二指腸、空腸、回腸、結腸的Peff值、Ka值之間均無顯著性差異(P>0.05),表明阿魏酸和芍藥苷在整個腸道內均有一定的吸收,且無特定的吸收部位(表2)。

表2 不同質量濃度香附四物湯在大鼠不同腸段中吸收參數

3 結論與討論

藥物在體腸吸收情況國內目前多采用在體腸循環技術進行研究。但是由于腸道能吸收水分,導致供試液體積改變,所以有必要對其進行校正[10]。試驗中通過在灌流液中加入不被腸吸收的物質-酚紅來標示灌流液體積的變化,使結果更為準確。

腸灌流的流速在一定程度上反應了腸道蠕動的情況,研究表明,隨著腸灌流速度的增加,腸道的吸收速率常數會顯著增加[11-12],且長時間、高流速的在體腸循環試驗會導致大鼠腸黏膜損傷,通透性增加,給實驗結果帶來較大誤差[13]。有文獻報道[14],健康人體內腸道的蠕動速度約為2 mL/min,而大鼠腸道的直徑約為人體腸道的1/10,因而選擇大鼠腸灌流流速為0.2 mL/min。所以,本試驗中建立的在體單向腸灌流模型以較低灌流速(0.2 mL/min)、較短的灌流時間(≤2 h)進行灌流,不僅可以較小程度地損傷大鼠腸黏膜,而且更接近實際的人體空腹狀態的情況。

在體腸循環實驗中,藥物對管壁的非特異性吸附也會產生試驗誤差,故試驗時需要對管路和腸管預平衡一段時間,使對管壁的吸附達到飽和,也使機體適應灌流過程[6]。本試驗以0.2 mL/min的較低流速灌流30 min使灌流液達到穩態后,開始收集腸灌流液樣品,從而保證試驗數據的可靠性,減少試驗誤差。

當某化合物在大鼠腸道內的平均Peff值小于0.03×10-4cm/s或大于0.2×10-4cm/s時,可以預測該化合物在人體內分別為吸收差或易吸收[15]。由試驗結果可知,香附四物湯中的活性成分阿魏酸及芍藥苷在體內較易吸收,且無特定吸收部位。此外,不同濃度的阿魏酸或芍藥苷在大鼠小腸內的Peff值均無明顯差異,表明阿魏酸及芍藥苷在小腸中的吸收無自身濃度抑制作用,推測其轉運機制可能是被動轉運。