斑葉香妃草的組培快繁

蘭 偉， 時玲玲

(阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

斑葉香妃草(Plectranthuscoleoides)又名銀斑香妃草、白邊延命草，為唇形科香茶菜屬多年生草本植物。其枝條拱形下垂，叢生，莖稈四梭形，葉對生，葉片綠色，邊緣銀白色。性喜全日照及溫暖濕潤的栽培環(huán)境，生長室溫15 ℃，夜溫10 ℃以上[1]。香味柔和，株形優(yōu)雅，可用作室內(nèi)觀賞、茶飲、美容、佐料，等，作為芳香植物亦可提取精油，廣泛用于化妝品、沐浴露、食品、牙膏、高級香水和其他生活用品，加工后的殘渣可以用作動物飼料添加劑，可以刺激禽畜的食欲，提高采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，還能抑菌防病，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，降低抗生素的用量，改善禽畜肉品質(zhì)，縮短存欄時間等功效[2-3]。另外，斑葉香妃草的藥用價值很高，具有強身、健胃、鎮(zhèn)痛、抑菌、去疤痕、抗抑郁等功效[4-5]，故民間稱其為白邊延命草。

隨著人們對高品質(zhì)生活的追求，斑葉香妃草的市場需求量較大，常規(guī)的繁殖方式不能滿足市場的需求。植物組織培養(yǎng)常用于植物離體快速繁殖，使用此種方法每年可以數(shù)百萬的倍數(shù)進(jìn)行繁殖[6]。現(xiàn)今植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在多種芳香植物中運用[7-9]，如洋苷菊、玫瑰、羽葉薰衣草等。植物組織培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基各種成分中，植物激素是必需的成分。它對外植體的分化起關(guān)鍵性作用，其中影響最為顯著的是生長素和細(xì)胞分裂素。本試驗主要探究6-芐基氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)配比對斑葉香妃草試管苗增殖的影響，以及不同濃度的吲哚乙酸(IAA)和NAA對試管苗增殖的影響，以及不同濃度IAA和NAA對試管不定根分化的影響,以期為斑葉香妃草的組培快繁提供理論及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為生長健壯、無病蟲害的斑葉香妃草植株，來源于阜陽師范學(xué)院生命與食品工程學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心。6-BA、NAA、IAA等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌材料的獲取 選取帶頂芽的斑葉香妃草嫩莖，每株莖段約有兩片嫩葉，外植體大小為0.5～1.0 cm，流水沖洗2 min后，先用70%乙醇浸泡20 s，再用 0.1% HgCl2浸泡8～10 min，無菌水沖洗5～6 次，置于無菌紗布中吸干水分，將消毒好的外植體接種于MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)瓶接種外植體3個，接種95瓶。待接種完畢后，將外植體放入組培室進(jìn)行培養(yǎng)，光照強度為2 000～3 000 Lx，培養(yǎng)溫度(23±2) ℃，光照時間12 h/d。

1.2.2 試管苗增殖培養(yǎng) 選用培養(yǎng)30 d，長勢良好、規(guī)格基本一致的試管苗兩個節(jié)莖段，接種于附加不同濃度6-BA和NAA配比的9組MS培養(yǎng)基中(表1)，以MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂基本培養(yǎng)基為對照組，每瓶接種3株外植體，每處理10瓶。各培養(yǎng)基pH均為5.8，光照強度為2 000～3 000 Lx (12 h/d)，溫度為(23±2) ℃的條件下培養(yǎng)。30 d后，每處理隨機(jī)選取6瓶，每瓶3株，觀察植株增殖情況。觀測指標(biāo)主要是植株的成活率，葉片數(shù)目，芽增殖倍數(shù)等狀況。其中，增殖倍數(shù)=出芽數(shù)(>0.5 cm)÷接種時的總芽數(shù)。

1.2.3 試管苗生根培養(yǎng) MS培養(yǎng)基中分別附加不同濃度的生長素NAA或IAA，進(jìn)行試管苗生根誘導(dǎo)(表2～3)。切取長勢良好、規(guī)格一致的試管苗兩個節(jié)莖段，接種到生根培養(yǎng)基上，每瓶3株無根苗，每處理組8瓶，每組3個重復(fù)，并于7 d后，隨機(jī)選取6瓶觀測并記錄，15 d后觀測并記錄植株存活狀況及生根狀況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度配比的6-BA、NAA對植株外植體增殖的影響

基本培養(yǎng)基中分別附加不同濃度配比的6-BA、NAA時，對植株的生長有較大影響(表1)。一般情況下，培養(yǎng)基中附加一定濃度配比的植物生長激素有利于植株的生長，但激素濃度過高則可能抑制植株生長。試驗結(jié)果表明，NAA濃度分別為0.025、0.05、0.1 mg/L時，隨著6-BA濃度增高，斑葉香妃草植株增殖倍數(shù)呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，可見6-BA濃度為0.1 mg/L時，抑制了斑葉香妃草試管苗增殖。在6-BA、NAA交互作用下，誘導(dǎo)斑葉香妃草腋芽分化的最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖倍數(shù)較其他試驗組明顯增多，為73個，平均增殖倍數(shù)最高，為4.06倍，植株葉片較多且嫩綠，莖段較粗壯，生長趨勢最好(圖1B)。培養(yǎng)基中附加6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.025 mg/L，斑葉香妃草出芽數(shù)最少，為32個，平均增殖倍數(shù)最小，為1.78倍，植株長勢相對健壯。空白對照組出芽數(shù)為49個，平均增殖倍數(shù)為2.72倍，但植株生長較為緩慢(圖1F)。6-BA、NAA對外值體的增殖是極顯著影響及顯著影響，并且對外植體的增殖存在極顯著影響(P<0.01)。試驗結(jié)果表明(圖1A、B)，一定濃度范圍內(nèi)，低濃度6-BA與較高濃度NAA成正比，植株葉片肥厚、葉色濃綠、大小正常，莖桿粗壯，長勢健壯。

表1 不同濃度配比的6-BA、NAA對試管苗增殖的影響

注：同列內(nèi)相同字母表示在0.05水平上差異不顯著。下同。

A.6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L B.6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L C.6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L

D.6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.025 mg/L E.6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L F.不加任何生長素

圖1 不同濃度配比下試管苗生長情況

2.2 不同濃度NAA對外植體生根的影響

培養(yǎng)7 d后，植株長出少許不定根，長勢良好，15 d后，形成的白色根系較為發(fā)達(dá)。由表3可知，加入一定濃度的NAA能夠促進(jìn)斑葉香妃草生根，植株和根系生長狀況良好，生根率為100%。NAA濃度處于0.03～0.09 mg/L時，植株的平均根數(shù)和平均根長總體呈增加趨勢，當(dāng)NAA濃度高于0.09 mg/L時，植株的平均根數(shù)和平均根長呈下降趨勢，由試驗結(jié)果可知，當(dāng)NAA濃度為0.09 mg/L時，平均根數(shù)和平均根長較其他組生長優(yōu)勢更為明顯，平均根數(shù)為8.75 個，平均根長為2.54 cm，最有利于斑葉香妃草的不定根分化。單因素方差分析結(jié)果顯示(表4)，根數(shù)的組間方差為16.066，組內(nèi)方差為0.127，根長的組間方差為0.803，組內(nèi)方差為0.039，根長和根數(shù)對應(yīng)的概率P值小于0.05，所以認(rèn)為NAA濃度對試管苗生根有極顯著差異。

表3 不同濃度NAA對試管苗生長的影響

表4 不同濃度NAA對試管苗生根的方差分析

2.3 不同濃度IAA對外植體生根的影響

由表5可知，MS基本培養(yǎng)基添加不同濃度的IAA，7 d統(tǒng)計1次，15 d后各組試管苗的生根率達(dá)到100%，不同濃度的IAA對植株的平均根數(shù)和平均根長的影響趨于平緩，對外植體不定根分化影響最為顯著的生長素濃度為0.03 mg/L，平均根數(shù)為5.96 個，平均根長為1.59 cm。各組差異均不顯著(P>0.05)。IAA濃度對試管苗生根沒有影響。

表5 不同濃度IAA對試管苗生長的影響

相同濃度條件下，NAA對斑葉香妃草的生根影響比IAA更佳，且長勢更好。NAA濃度為0.09 mg/L時，更適宜外植體不定根的分化。由方差分析結(jié)果可知，NAA對斑葉香妃草的生根作用比IAA更為顯著(表6)。

表6 不同濃度IAA對試管苗生根的方差分析

3 結(jié)論與討論

目前，植物組織培養(yǎng)已成為一種植物學(xué)研究的常用方法，特別是在植物的個體發(fā)育，器官再生等方面。在運用此種技術(shù)時，一般植物都適用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[10]。植物生長調(diào)節(jié)劑是通過調(diào)整植物內(nèi)源激素的比例進(jìn)而使植株發(fā)生形態(tài)上的差異，在培養(yǎng)基中加入適宜激素，能顯著提高植物生長效果[11-12]，不同植株對相同濃度激素的敏感程度不同，因此最適于植株生長的激素濃度配比不同，如最適宜黃金香柳試管苗快速增殖的培養(yǎng)基是MS+0.1 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA[13]，最適宜斑葉百里香種子的培養(yǎng)基是MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA[14]。

本文探究斑葉香妃草生長調(diào)節(jié)劑組合和不同濃度配比對誘導(dǎo)試管苗腋芽及不定根分化的影響及組培苗生長發(fā)育情況。試驗結(jié)果表明，6-BA/NAA的濃度配比為3∶1時，斑葉香妃草出芽率最高，生長狀況最佳，每組出芽數(shù)為73個，增殖倍數(shù)為4.06倍，方差分析結(jié)果也表現(xiàn)為影響極為顯著。在一定條件下，NAA對斑葉香妃草試管苗的不定根生長作用比IAA更為顯著，培養(yǎng)基中NAA 0.09 mg/L時，斑葉香妃草生長效果最好，平均根長為2.54 cm，平均生根數(shù)為8.75 個。綜上所述，MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA對試管苗增殖倍數(shù)的影響最為顯著，MS+NAA 0.09 mg/L促進(jìn)試管苗生根的效果最佳。