三種天然防腐劑對五種常見微生物抑菌作用的研究

馮林慧，李迎秋，張鑫

(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，濟南 250353)

食品加工和儲藏過程中發生的食品腐敗變質是目前食品工業面臨的主要問題之一。化學防腐劑廣泛地應用在食品工業中，從而有效地控制了食品中腐敗微生物的生長。近年來，化學防腐劑的潛在毒性以及微生物耐藥性的出現，使得人們越來越關注天然防腐劑的開發與研究[1]。天然防腐劑來源廣泛，普遍存在于植物、動物、微生物中。天然防腐劑具有很多優點，如對高等動物正常細胞基本無毒副作用、水溶性良好、抗菌性好且不易產生耐藥性[2]。

大豆球蛋白堿性多肽(植物來源)是從豆粕中提取出的一種陽離子肽，具有廣譜抑菌性，且對人體胚胎腎細胞無毒性[3,4]。殼聚糖(動物來源)是甲殼素脫乙酰基后的一種堿性多糖，來源豐富，由于其良好的成膜性被應用于果蔬保鮮中[5]。乳酸鏈球菌素是(微生物來源)由乳酸鏈球菌產生的含34個氨基酸的一種多肽，是世界上公認的無毒副作用的天然食品防腐劑[6]。本實驗選取李斯特菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉，研究以上3種不同來源的天然防腐劑的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

大豆球蛋白堿性多肽：實驗室富集所得；殼聚糖：山東濰坊海之源生物有限公司；乳酸鏈球菌素：浙江銀象生物工程有限公司；其余試劑：均為分析純。

1.1.2 培養基及菌種

腦心浸液肉湯培養基(用于李斯特菌培養)、牛肉膏蛋白胨培養基(用于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(用于白色假絲酵母、黑曲霉培養)。李斯特菌ATCC 19115、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 9027、白色假絲酵母ATCC 10231、黑曲霉菌ATCC 16404：齊魯工業大學菌種保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

1.2.1.1 細菌和酵母菌菌懸液的制備

將細菌分別接種于腦心浸液肉湯瓊脂斜面培養基和牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基，置于37 ℃下培養24 h；將酵母菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基，置于37 ℃下培養60 h。然后挑取細菌和酵母菌菌落分別接種于腦心浸液肉湯液體培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基和馬鈴薯葡萄糖液體培養基，在37 ℃條件下恒溫振蕩培養過夜，平板計數測定菌體濃度，將培養液稀釋成菌體濃度為107cfu/mL的菌懸液，4 ℃冰箱暫存備用。

1.2.1.2 霉菌孢子懸液的制備

將黑曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，28 ℃下培養60 h。然后用20 mL無菌水洗下孢子，渦旋振蕩，調整孢子含量為107個/mL的菌懸液，4 ℃冰箱暫存備用。

1.2.2 防腐劑母液的配制

大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素用無菌水配制成質量濃度為30 mg/mL的溶液，無菌過濾，4 ℃保存備用。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

1.2.3.1 細菌和酵母菌最小抑菌濃度(MIC)的測定

將大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素的母液分別加入到細菌和酵母菌的菌懸液中，使3種防腐劑的終濃度為0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，于37 ℃振蕩培養24 h，用無菌水代替防腐劑作為陽性對照，用液體培養基代替菌液作為陰性對照，空白參比為陰性對照，在620 nm波長處測OD值。

1.2.3.2 霉菌最小抑菌濃度(MIC)的測定[7]

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和3種防腐劑均勻混合，使混合培養基中防腐劑的最終濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，待溫度降至50 ℃左右后，將混合培養基倒入無菌平板中，冷卻。分別取100 μL孢子懸浮液注入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基表面，用無菌玻璃涂布棒涂布均勻，放置5 min，然后放入培養箱中，于28 ℃下倒置培養7天。用無菌水代替防腐劑作為陽性對照，每個濃度做3個平行，觀察其生長狀況，以肉眼看不到菌絲生長的最小防腐劑濃度作為最小抑菌濃度。

2 結果與討論

2.1 大豆球蛋白堿性多肽最小抑菌濃度(MIC)的測定

大豆球蛋白堿性多肽對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度見表1。

表1 大豆球蛋白堿性多肽對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。

大豆球蛋白堿性多肽對霉菌的最小抑菌濃度見圖1。

圖1 大豆球蛋白堿性多肽對霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽性對照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

本文選取的5種菌中，李斯特菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的代表，綠膿桿菌則為革蘭氏陰性菌，白色假絲酵母為酵母菌，黑曲霉為霉菌。由表1和圖1可知，大豆球蛋白堿性多肽對李斯特菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌3種細菌的最小抑菌濃度依次增大，分別為0.125，0.25，0.5 mg/mL；對白色假絲酵母的最小抑菌濃度為1.0 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為1.5 mg/mL。由此說明，大豆球蛋白堿性多肽對細菌有良好的抑菌作用，對革蘭氏陽性菌的抑制作用尤其明顯。這可能是由于綠膿桿菌作為革蘭氏陰性菌具有脂多糖的雙層膜比革蘭氏陽性菌的單層膜對大豆球蛋白堿性多肽的耐受性好[8]。大豆球蛋白堿性多肽對酵母菌的抑制作用不明顯，對霉菌的抑菌效果尤其微弱。

2.2 殼聚糖最小抑菌濃度(MIC)的測定

殼聚糖對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度見表2。

表2 殼聚糖對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。

殼聚糖對霉菌的最小抑菌濃度見圖2。

圖2 殼聚糖對霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽性對照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

由表2和圖2可知，殼聚糖對李斯特菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對綠膿桿菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL，對白色假絲酵母的最小抑菌濃度為2.0 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為2.0 mg/mL。殼聚糖對于金黃色的葡萄球菌的抑菌效果明顯優于其他4種菌，對于酵母菌和霉菌的抑菌效果最差。

2.3 乳酸鏈球菌素最小抑菌濃度(MIC)的測定

乳酸鏈球菌素對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度見表3。

表3 乳酸鏈球菌素對細菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。

乳酸鏈球菌素對霉菌的最小抑菌濃度見圖3。

圖3 乳酸鏈球菌素對霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽性對照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

由表3可知，乳酸鏈球菌素對李斯特菌和白色假絲酵母的最小抑菌濃度均為0.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對綠膿桿菌的最小抑菌濃度為1.5 mg/mL。乳酸鏈球菌素同樣對于金黃色葡萄球菌有非常好的抑制性，對于李斯特菌和白色假絲酵母的抑菌能力相對較差。綠膿桿菌的細胞壁組成致密，可以將分子質量為3500 D的乳酸鏈球菌素阻擋在胞外，因而乳酸鏈球菌素對綠膿桿菌的抑菌效果微乎其微[9]。由圖3可知，乳酸鏈球菌素對黑曲霉無抑菌效果，這與張旋等[10]的研究結果一致。

3 結論

實驗結果表明，大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素對于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.25 mg/mL，說明3種天然防腐劑對于金黃色葡萄球菌均有較強的抑菌作用。大豆球蛋白堿性多肽對李斯特菌的抑制效果最佳，最小抑菌濃度為0.125 mg/mL；其他2種防腐劑對李斯特菌的抑制效果稍差，最小抑菌濃度都是0.5 mg/mL。大豆球蛋白堿性多肽和殼聚糖對綠膿桿菌的最小抑菌濃度均為0.5 mg/mL，對白色假絲酵母的最小抑菌濃度分別為1，2 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度分別為1.5，2.0 mg/mL。乳酸鏈球菌素與其他2種防腐劑相比，對黑曲霉沒有抑菌效果；對綠膿桿菌的抑制效果最不理想，最小抑菌濃度為1.5 mg/mL；而對于白色假絲酵母的抑菌性最好，最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。本實驗證明了3種天然防腐劑具有良好的抑菌效果，但同時發現單一防腐劑使用的局限性，因此天然防腐劑的復合使用將是食品工業中一大熱點。